吡虫啉处理对东亚飞蝗解毒和防卫基因表达的影响

摘要

吡虫啉是新烟碱类杀虫剂，该产品杀虫谱广，低毒高效，应用广泛。粘质沙雷氏菌广泛分布于自然界，是水和土壤中的常居菌群，对黄胫小车蝗(Oedaleus infernalisSaussure)有很高的毒力，有较好的生防效果。东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)作为一种模式昆虫，在组织观察及模型构建，杀虫菌株及杀虫活性物质筛选等方面应用广泛。为初步探究昆虫中肠解毒、免疫、消化相关基因对不同剂量吡虫啉的响应机制，以及吡虫啉和粘质沙雷氏菌对昆虫血淋巴免疫系统的影响，本研究以东亚飞蝗为实验材料，开展了相关的研究工作。
　　一、高低剂量吡虫啉处理下东亚飞蝗中肠转录组的测序及数据分析
　　通过生物测定，本研究分别选用吡虫啉LD10(0.037 mg/虫)和LD80(4.11 mg/虫)作为低剂量和高剂量，处理东亚飞蝗成虫（雌雄各半）。无菌解剖取样，RNA提取检测合格后，利用Illumina Hiseq2000平台测序。组装结果总共Unigene59331个，平均长度747 nt，N50达到1187 nt。 Unigene功能注释，注释到NR，NT，Swiss-Prot，KEGG，COG，GO库的Unigene分别是23201个、11141个、18837个、16709个、9818个、11585个，所有注释上的Unigene是25531个。进一步分析显示，注释为解毒酶的Unigene受低剂量吡虫啉影响更多，影响最显著的是细胞色素P450s（差异表达个数/测得总数=47.19％）。解毒酶中差异表达Unigene最多的是P450s的6family，CarEs的A clade和GSTs的sigma class，而葡萄糖醛酸转移酶UGTs大部分Unigene在吡虫啉处理后呈下调趋势。免疫相关基因在高低剂量吡虫啉处理后，响应Unigene数量差距不明显。溶菌酶、双翅肽、ApolipophorinⅢ、转铁蛋白在高低剂量处理中均呈下调趋势，仅防御素在高剂量处理中特异上调。消化酶基因在不同剂量的吡虫啉处理中，差异表达的基因种类更为丰富和复杂。11个编码糜蛋白酶(chymotrypsin)的unigenes中，9个在吡虫啉处理后出现差异表达，其中8个为显著下调。
　　二、高低剂量吡虫啉处理后东亚飞蝗中肠转录组部分差异表达基因的定量验证
　　本研究综合unigene长度、差异表达倍数等因素，选择部分解毒酶、免疫相关基因进行定量验证。定量结果显示，在选择验证的23个基因中，76.08％结果与转录组一致，验证了转录组的准确性。在细胞色素P450s基因中，共选择了6个基因分别在高低剂量吡虫啉处理后进行了验证，与转录组结果一致的占到了75.00％。定量结果显示CYP6K1(CL4043C2)表达差异最为显著，在高剂量吡虫啉处理后上升了10.07倍，在低剂量吡虫啉处理后上升了9.32倍。CYP6BQ37(U27188)在高剂量吡虫啉处理后上升了6.68倍，而低剂量处理和对照不存在显著差异，表现出剂量依赖性诱导高表达;与此相反，CYP6HQ1(CL659C2)在低剂量处理后上升了6.54，而高剂量处理与对照间不存在显著差异，同样表现出剂量依赖性诱导高表达。在谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)中，共选择了4个基因进行了验证，与转录组结果一致的占到了75.00％。其中，GSTS2(CL1173C2)在高剂量吡虫啉处理后上调了9.00倍，而低剂量处理和对照不存在显著差异;GSTD5(U33519)、 GSTO3(CL3618C4)和GSTS1(CL4610C5)在低剂量吡虫啉处理后分别上调了10.34、8.34和3.04倍，而高剂量处理与对照间不存在显著差异，均表现出剂量依赖性诱导高表达。在羧酸酯酶(CarEs)中，共选择了4个基因进行了验证，与转录组结果一致的占到了50.00％。CesD1(U30920)和CesA20(U6549)高剂量吡虫啉处理后分别上调7.03倍和13.32倍，而低剂量处理和对照不存在显著差异;而CesA3(CL3747C1)在低剂量吡虫啉处理后上调了4.50倍，而高剂量处理与对照间不存在显著差异。CesA8(U12483)高、低剂量吡虫啉处理后分别上调3.37倍和5.46倍。
　　在免疫防御相关基因中，共选择了9个基因进行了验证，与转录组结果一致的占到了88.89％。结果显示， Mucin-5(CL2786C1)基因差异表达量最高，高剂量吡虫啉处理后上调12.2倍，低剂量吡虫啉处理后上调9.23倍;PGRP1(CL2306C2)在高剂量处理后上调11.67倍，低剂量处理后上调7.96倍;Serpin4(CL2600C2)在高剂量吡虫啉处理后上调7.18倍，低剂量吡虫啉处理后上调10.08倍。Defensin-1(U43570)在高剂量吡虫啉处理后上调5.17倍，而低剂量处理和对照不存在显著差异。Diptericin(U8926)在高低剂量吡虫啉处理后均下调，分别为对照的0.25倍和0.12倍。
　　三、吡虫啉、粘质沙雷氏菌对东亚飞蝗血淋巴免疫通路基因的调控
　　为了更好的了解吡虫啉对东亚飞蝗免疫影响，以及免疫系统的响应机制，本研究用低剂量吡虫啉和粘质沙雷氏菌（实验室分离的一株高致病菌）饲喂东亚飞蝗。采用荧光定量分析方法，分别检测了血淋巴中IMD信号通路和Toll信号通路的2个关键基因，IMD信号通路的关键基因为:PGRP-LE和Relish; Toll信号通路的关键基因为:GNBP3和MyD88。并分别检测了IMD信号通路的产物之一:双翅肽(diptericin)和Toll信号通路的产物之一:防御素(defensin)。粘质沙雷氏菌处理后，IMD信号通路上的Relish上调了9.50倍，PGRP-LE上调了6.06倍，但是IMD信号通路的产物之一Diptericin却没有出现显著差异。粘质沙雷氏菌处理后，Toll信号通路的GNBP3上调了4.94倍，但产物之一的Defensin-1显著下调。在低剂量吡虫啉处理后，东亚飞蝗血淋巴免疫防御的IMD信号通路的Relish和通路产物Diptericin分别上调了6.77倍和7.88倍。但是，吡虫啉处理对Toll信号通路的GNBP3和MyD88均没有显著影响，而Toll信号通路产物Defensin-1显著下调。
　　综合中肠和血淋巴两部分结果，不同剂量吡虫啉对同一免疫组织的诱导情况不同，暗示昆虫在不同剂量吡虫啉胁迫下响应机制不同。同浓度吡虫啉对不同组织的免疫诱导也有很大差别，暗示不同组织在接触杀虫剂后，采取了不同的应对策略，同一抗菌肽在不同组织中的作用可能有所差别。吡虫啉能够诱导东亚飞蝗血淋巴的IMD信号通路，而对Toll信号通路诱导效果不明显，暗示吡虫啉与真菌或革兰氏阳性菌复配使用能够起到更好的杀虫效果。本研究推测不同杀虫剂能够诱导昆虫特定的免疫通路，为杀虫真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌与农药的复配提供了新的思路和理论依据。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．昆虫对外界刺激的反应

1．1 昆虫体外的免疫防卫反应

1．2 昆虫体内的免疫防卫反应

1．3 昆虫解毒酶类的诱导代谢反应

2．昆虫免疫系统

2．1 物理屏障

2．2 细胞免疫

2．3 体液免疫

2．4 免疫对昆虫本身的影响

2．5 杀虫剂对昆虫免疫系统的影响

3．东亚飞蝗概述

3．1 东亚飞蝗生物学特点

3．2 东亚飞蝗作为模式昆虫的概述

4．研究的目的与意义

第二章 吡虫啉处理对东亚飞蝗中肠解毒、免疫和消化相关基因以及血淋巴免疫相关基因的调控

1．材料与方法

1．1 供试虫源

1．2 实验试剂

1．3 试验方法

1．4 荧光定量

2．结果与分析

2．1 生物测定结果

2．2 东亚飞蝗中肠转录组测序

2．3 吡虫啉处理影响东亚飞蝗中肠转录组解毒酶、免疫防御、消化酶基因差异表达分析

2．4 吡虫啉诱导东亚飞蝗中肠中差异表达的解毒酶、免疫防御相关基因定量验证

2．5 粘质沙雷氏菌、吡虫啉对东亚飞蝗免疫相关基因的影响

3．讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢