OsPT2基因过表达对低磷胁迫下菜用大豆结瘤固氮及氮代谢的影响

摘要

菜用大豆，又称毛豆，指在鼓粒末期籽粒饱满而尚未老熟时采青食用的大豆[Glycine max(L.) Merrill]，是大豆的专用型品种。豆科植物根瘤中的固氮过程是一个高耗能过程，有较高的磷素需求。然而由于磷素在土壤中易被固定、难以移动导致土壤中能被植物吸收利用的有效磷含量较低，土壤缺磷已成为共生固氮豆科植物生产的重要制约因素。因此，培育低磷环境下高效固氮的豆科品种对减少氮肥、磷肥的施用以及增强农业的可持续性有重要意义。水稻磷转运蛋白基因OsPT2受低磷诱导显著增强表达，主要起到转运植物体内磷素的作用。在前期研究中我们已获得转OsPT2基因磷高效利用的T3代菜用大豆种子，本研究以此为试验材料，将分离纯化的日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)接种于转基因植株，采用蛭石盆栽的方法进行低磷处理试验，探究OsPT2基因的过表达能否提高转基因植株的结瘤固氮及氨同化能力，为培育氮磷协同高效的菜用大豆新品种提供理论依据和新种质。主要研究结果如下:
　　1、从大豆新鲜根瘤中分离纯化得到3个分离物，分别命名为NAU1301、NAU1302、NAU1303，通过菌落形态观察以及采用16S-23S rDNA基因间隔序列分析技术进行菌种鉴定，确认了分离的3个菌株均为Bradyrhizobium japonicum（日本慢生根瘤菌）。结瘤实验进一步确认了分离物为根瘤菌，均能与菜用大豆（‘新辽鲜’品种）共生结瘤并具备固氮能力，对植株生长具有促进作用。
　　2、采用砂培方法，设置5个磷水平5、10、20、40、1000μM（正常磷水平），研究低磷胁迫对菜用大豆结瘤和固氮能力的影响。低磷条件下植株各器官有效磷和总磷含量显著低于正常磷水平;低磷胁迫显著降低了菜用大豆根瘤的生长发育和固氮能力，表现为株高、叶面积、地上部生物量、根瘤干重和根瘤体积显著降低，植株总氮含量呈下降趋势。低磷处理下根瘤干重降低的幅度比地上部干重、根系干重降低的幅度大，表明和植株生长相比，根瘤生长对缺磷更敏感。荧光定量PCR分析显示，和正常磷水平相比，在根瘤发育过程中(0-11 d)，结瘤关键基因GmENOD40-1、GmENOD40-2、GmNIN1a、GmNIN1b、GmRIC1和GmRIC2的表达量在低磷处理的不同时间点显著降低;早期结瘤信号识别的受体激酶基因GmNFR1α/β、GmNFR5α/β、GmSymRKα/β的表达量在低磷和正常磷处理之间并无显著差异。表明低磷胁迫通过抑制若干结瘤关键基因的表达而抑制根瘤后期的发育、成熟，但对早期根瘤菌结瘤因子信号的识别过程没有影响。
　　3、以三个T3代纯合株系转OsPT2基因菜用大豆（编号12PT2-1-1-1、12PT2-2-1-3和12PT2-4-3-1）为试验材料，采用蛭石盆栽的方法进行低磷实验，探究低磷条件下OsPT2过表达对菜用大豆结瘤固氮和氨同化能力的影响。结果显示，低磷条件下T3代转基因植株的生长表现、种子重量和根瘤发育均显著优于野生型。T3代转基因植株的磷含量、总氮含量及酰脲浓度显著高于野生型植株，说明过表达OsPT2基因促进了低磷条件下转基因植株体内磷、氮、酰脲的积累。荧光定量PCR分析显示，低磷处理24 d和32d，早期结瘤素基因（GmENOD40-1、GmENOD40-2），豆血红蛋白基因（GmLba）和谷氨酰胺合成酶基因（GmGS1β1、GmGS1β2）在T3代转基因植株的表达量显著高于野生型;GmGS1β1和GmGS1β2基因表达量的增加和转基因植株中GS酶活性的增加一致。GmLba基因表达量的增加和转基因植株中豆血红蛋白含量的增加相一致。以上结果表明，低磷胁迫下OsPT2基因过表达显著促进了菜用大豆体内磷素的积累，增强结瘤固氮相关基因的表达，进而提高了转基因菜用大豆的固氮和氨同化能力。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 文献综述

1 生物固氮的概念和意义

1．1 生物固氮的方式

2 豆科植物-根瘤菌共生体系的建立

2．1 根瘤形成过程

2．2 参与共生固氮的根瘤菌基因

2．3 参与共生固氮的植物基因

3 低磷胁迫对豆科植物-根瘤菌共生固氮体系的影响

3．1 土壤低磷问题

3．2 低磷对豆科植物结瘤及固氮功能的直接影响

3．3 氮反馈机制

3．4 低磷胁迫下根瘤维持磷稳态的机理

4 改善共生固氮的途径

第二章 根瘤菌的分离、纯化及结瘤实验

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 菌落特征

2．2 根瘤菌DNA的提取及IGS基因的PCR扩增

2．3 IGS基因序列的生物信息学分析

2．4 结瘤实验结果

3 讨论

第三章 不同磷水平对菜用大豆结瘤固氮的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 不同低磷水平对菜用大豆植株生长和结瘤的影响

2．2 不同低磷水平对菜用大豆各器官有机磷、总磷和总氮含量的影响

2．3 低磷处理对结瘤相关基因表达的影响

3 讨论

3．1 低磷抑制菜用大豆植株的生长、根瘤的生长发育及固氮能力

3．2 低磷抑制结瘤关键基因的表达

第四章 OsPT2基因过表达对低磷胁迫下菜用大豆共生固氮的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

2 结果

2．1 转基因植株的PCR鉴定

2．2 植株生物量、产量及结瘤表现

2．3 植株各器官有效磷、总磷、总氮及酰脲含量

2．4 植株谷氨酰胺合成酶活性及豆血红蛋白含量

2．5 结瘤固氮及氮同化相关基因的表达

3 讨论

3．1 OsPT2基因过表达促进转基因菜用大豆根瘤的生长发育

3．2 OsPT2基因过表达增强转基因菜用大豆的固氮能力和氨同化效率

3．3 OsPT2基因过表达有利于转基因菜用大豆根瘤磷稳态的维持

全文结论

创新之处

参考文献

攻读博士学位期间发表学术论文情况

致谢