马铃薯甲虫谷胱甘肽转移酶家族基因的鉴定及其对三种杀虫剂的响应

摘要

马铃薯甲虫是取食马铃薯叶片的重要害虫，常引起马铃薯产量的巨大损失。长期的化学杀虫剂使用导致抗药性快速发展，这使防治难度变得更大。研究发现，谷胱甘肽转移酶(glugathione S-transferase，GST)活性增强导致马铃薯甲虫幼虫对伏杀硫磷及氯菊酯的抗性。我们之前增效剂测定实验也表明，GST可能参与多种杀虫剂的解毒代谢。目前，马铃薯甲虫的GST基因家族尚未系统鉴定，参与杀虫剂代谢的GST基因也尚未明确。有鉴于此，本文主要开展了以下3个方面的工作。
　　一、马铃薯甲虫GST基因挖掘及鉴定
　　基于马铃薯甲虫的基因组和转录组数据，经过同源搜索和基因预测，发现34个GST候选序列。采用RT-PCR验证了上述候选GST基因序列的正确性，应用RACE技术获得了部分GST基因的全长cDNA序列(GenBank登录号为KU522306-KU522339)。结合赤拟谷盗、黑腹果蝇、家蚕、西方蜜蜂、冈比亚按蚊和豌豆蚜的GST蛋白，建立了系统发育树，分析了它们的系统进化。最终，我们获得了30个GST基因，其中29个基因编码细胞质GST，1个基因编码微粒体GST。29个细胞质基质基因中，3、10、5、4、4、1个基因分属于delta、epsilon、omega、sigma、theta和zeta亚家族。另外2个GST基因不属于已知亚家族而未能归类。
　　二、马铃薯甲虫GST基因结构分析
　　通过对GST基因进行系统发育及结构分析，我们发现，30个GST基因分布在17个染色体骨架(scaffolds)上。10个epsilon亚家族的GST基因中，有8个(LdGSTe1至LdGSTe8)分布在染色体骨架12上，2个(LdGST9和LdGSTe10）分布在染色体骨架1223上。亚家族epsilon的GST基因在染色体上的位置与系统发育树中预测的进化过程是一致的。另外，马铃薯甲虫中2个omega亚家族和1个sigma亚家族GST基因位于染色体骨架134。3个sigma亚家族GST基因位于scaffold521。2个未归类GST基因位于染色体骨架615。其他GST基因则分别位于不同的染色体骨架。还分析了马铃薯甲虫GST基因的内含子-外显子结构。30个GST基因共包含83个内含子。平均每个GST基因包含2.8个内含子。不存在不包含内含子的基因。另外，我们还发现LdGSTe2、LdGST和LdGSTo3存在多个可变剪切体。
　　三、三种杀虫剂（高效氯氰菊酯、氟虫腈、硫丹）诱导GSTs的表达动态
　　经高效氯氰菊酯处理后存活的马铃薯甲虫，其LdGSTe2a、LdGSTe2b、LdGSTe10、LdGSTu2、LdGSTo5和LdGSTt1表达水平分别上调18.0、9.8、3.4、11.8、4.9和21.4倍。与此类似，氟虫腈处理后，LdGSTe2a、LdGSTe2b、LdGSTo5和LdGSTt1分别上调了3.6、28.3、4.8和6.6倍。硫丹处理后，LdGSTd1、LdGSTe2a、LdGSTe2b、LdGSTu2、LdGSTo5和LdGSTt1的转录水平分别上调了4.9、5.9、13.8、9.4、12.0和4.1倍。高效氯氰菊酯处理后，LdGSTe4和LdGSTe6的mRNA表达水平显著下降。氟虫腈处理明显降低了LdGSTe4、LdGSTe6和LdGSTe10的转录水平。硫丹处理明显降低了LdGSTe4、LdGSTe6和LdGSTz1的表达水平。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．马铃薯甲虫的发生分布与危害

1．1 马铃薯甲虫的发生分布

1．2 马铃薯甲虫的危害

2．马铃薯甲虫防治现状

2．1 农业及物理防治

2．2 生物防治

2．3 化学防治

3．马铃薯甲虫抗药性的产生

4．2 行为抗性

4．3 靶标敏感性下降

4．4 解毒作用增强

5．GST家族基因与抗药性的关系

5．1 不同昆虫GST家族基因

5．2 GST基因与抗药性产生的关系

5．3 GST不同亚家族与抗药性的关系

6．本研究的立题背景和意义

第二章 GST分子鉴定及系统进化分析

1 材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要仪器设备和试剂

1．3 实验方法

2 结果与分析

2．1 马铃薯甲虫GST转录本的测序及鉴定

2．2 系统进化分析

2．3 马铃薯甲虫GST类别

3 讨论

第三章 GST结构分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 马铃薯甲虫GST基因结构

2．2 马铃薯甲虫GST内含子-外显子结构

3 讨论

第四章 高效氯氰菊酯、氟虫腈以及硫丹药物诱导处理

1．材料与方法

1．1 供试昆虫

1．2 主要试剂

1．3 试验方法

2 结果与分析

2．1 杀虫剂诱导的GST基因

2．2 杀虫剂抑制的GST基因

3 讨论

全文总结

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

附录

致谢