一个陆地棉小G蛋白基因GhRab11d3及其启动子的特征与功能分析

摘要

棉花作为世界上最重要的经济作物之一，给人类提供了非常重要的天然纤维。随着棉花基因组序列解析的巨大进展，从棉花全基因组中发掘重要的纤维发育的优良基因并功能分析，将促进棉花的品质和产量改良。Rab蛋白是小G蛋白家族中最大的一个家族，其作为棉花中重要的一个家族，很多成员在纤维发育过程中都发挥十分重要的作用。 通过全基因组分析Rab基因家族成员的序列、分类、基本生物信息、基因结构、染色体分布以及表达特征，可为相关基因的克隆和功能研究提供重要依据。到目前为止，拟南芥57个Rab基因家族成员的鉴定工作已完成，但在棉花中，还未有相关基因家族的研究报道。本研究结合释放的棉花基因组信息，对棉花Rab基因家族成员进行分析。进一步通过差异表达分析，发现一个在纤维伸长发育中差异表达的Rab基因，结合其在家族表达模式热图，发现其在纤维伸长期中优势表达，将该基因命名为GhRab11d3。对该基因及其启动子克隆，并对其特征和功能进行了系统研究，主要研究结果如下: 通过检索二倍体雷蒙德氏棉的全基因组数据库，一共获得87个属于Rab基因家族的成员，通过拟南芥的命名法则并结合哺乳动物的命名规则，对每个成员分别进行命名。生物信息分析表明，棉花Rab基因家族成员氨基酸数目是200-300aa，蛋白分子量都处于20-30Kda之间，这与Rab蛋白本身所具有的性质保持一致。染色体分布图表明除2个基因没有找到相对应的物理位置外，其余85个Rab基因家族成员分布在雷蒙德氏棉的全部13条染色体上，在第10条染色体上分布的Rab基因最多，有11个，而在第4条染色体上分布的基因最少，只有2个。系统进化分析表明，这87个成员被分为八大类，与已报道的拟南芥Rab家族分类相对应，每一大类成员之间有着相似的功能。基因结构分析发现，同一大类成员中的内含子数目基本一致，即同一大类成员的基因结构基本相似。对雷蒙德氏棉中所对应的TM-1成员中其转录组数据的表达模式分析，发现大约有161个基因至少在一个组织器官中被检测到有表达，说明大多数Rab家族成员在棉花的不同生长发育阶段都至少会发挥一定功能。大约有一半基因会在棉花的营养器官、花器官以及纤维胚珠器官中都有所表达，说明这些基因是组成型表达基因，它们会参与棉花的整个生长发育进程，在功能上具有多样性。少数基因分别在某个或某类组织器官中表达，说明这些基因在功能上比较专一。还有一些基因的表达模式则不明确，未发现规律。 Li1野生型具有正常发育的纤维，而突变体具有超短纤维表型。通过差异显示分析，发现了一个在Li1突变体和野生型纤维发育时期差异表达的Rab基因。进一步对该基因在Li1突变体和野生型不同纤维发育组织中进行定量表达分析，证明在8DPA、10DPA、12DPA以及15DPA的纤维组织中，该基因在野生型中的表达量极显著高于突变体，表明该基因对纤维伸长具有正向调控作用。结合Rab基因家族研究结果，发现该基因对应命名为GhRab11d3，从表达模式热图结果可以看出该基因属于组成型表达，但是在纤维伸长期优势表达。 GhRab11d3基因全长cDNA为690bp，编码229aa，具有Rab蛋白典型的四个鸟嘌呤核苷酸结合结构域以及C末端的两个半胱氨酸的结构特点，等电点pI为6.84，分子量Mw大小为25.16KDa。该基因在陆地棉遗传标准系TM-1的各个组织器官中均表达，尤其在纤维快速伸长期的表达量最高。通过转化棉花原生质体以及注射烟草的体内体外亚细胞定位方法，结果表明该蛋白位于细胞的内膜系统中，包括细胞膜、细胞质以及细胞核，通过细胞器Marker蛋白标记的红色荧光信号与目的蛋白的绿色荧光信号进行共定位，发现涉及到的具体细胞器有内质网。 为了进一步验证该基因的功能，构建了组成型强启动子35S和纤维特异启动子RDL驱动的GhRab11d3的正反义表达两套载体，通过农杆菌介导进行了棉花的稳定遗传转化研究。除了35S-ASC载体在侵染50天后出现愈伤褐化死亡的现象，无法获得转基因后代株系以外，其余三个载体均获得了一批转基因成功的后代纯合株系。 通过转基因后代与受体W0在纤维伸长期5DPA、10DPA、15DPA的定量qPCR分析，发现35S-SC的303株系和RDL-SC的210株系等其目标基因表达量显著增加，而RDL-ASC的98株系其目标基因表达量被显著抑制，因此选择这三个株系开展目标基因功能验证分析。通过比较这三个转基因株系与受体W0在纤维发育10DPA、15DPA、20DPA和成熟期的纤维长度，发现正义载体的纤维显著变长，反义载体的纤维长度显著缩短。其10DPA和15DPA铃的大小分析表明，相比受体W0，转基因正义载体的铃变大，反义载体的铃变小。 通过酵母双杂交共转化以及双分子荧光互补BiFC分析，证明GhRab11d3与在纤维伸长期优势表达的四个细胞骨架蛋白GhACTa、GhACTb、GhACT2、GhACT4均存在互作，且与GhACTb和GhACT2的互作更强。暗示GhRab11d3在囊泡运输过程中会沿着细胞骨架蛋白ACTIN运输细胞壁的组份多糖类物质，在此过程中，一方面会对细胞骨架蛋白微丝F-Actin的形态结构产生一定影响，另一方面会对细胞骨架蛋白微丝F-Actin的密度或者数量产生变化，同时，纤维细胞顶端的囊泡数量产生变化，使得囊泡运输能力受到影响，最终运输到细胞壁的果胶物质含量也会受到影响。发现正义载体的纤维组织中果胶含量显著增加，而反义载体的果胶含量减少，这可能是使纤维长度发生变化的主要原因。 为了更好地认识该基因的功能，克隆了位于GhRab11d3起始密码子ATG上游1，546bp长度的序列，以此作为该基因的启动子，并将其命名为pGhRab11d3进行启动子特征分析。预测该启动子转录起始位点TSS位于ATG上游312bp处的碱基T处，将其标记为-312bp。通过PlantCARE和PLACE在线网站对启动子的顺式作用元件进行预测，发现了TATA-box和CAAT-box基本元件，重要转录因子结合位点元件，几种激素诱导元件以及调控种子萌发和花粉管生长的作用元件等等。将pBI121载体用HindⅢ和BamHI酶切位点切掉35S启动子后，构建五段连有GUS报告基因的缺失启动子载体，分别为P1(196bp)、P2(385bp)、P3(546bp)、P4(746bp)以及P5(1，546bp)。对每段缺失启动子载体进行了烟草的稳定遗传转化，在转基因烟草中，pGhRab11d3主要在烟草的花瓣、花药、花梗以及胚珠这些生殖器官中发挥功能。GUS染色和GUS酶活测定结果表明，P1(196bp)和P2(385bp)与对照WT没有明显差别，从P3(546bp)开始，可以观察到明显的GUS染色，GUS酶活也是极显著增加，说明该启动子从P3(546bp)开始具有转录活性，所以认为起始密码子ATG上游的546bp启动子长度对于驱使下游GUS基因的表达是所必需的。从中还可以推断出pGhRab11d3的核心启动子元件位于P2(385bp)和P3(546bp)之间，可能是MYB转录因子结合位点(492bp)或者MADS转录因子结合位点(417bp)。另外，发现546bp的上游序列中还含有增强下游基因表达的调控元件。GhRab11d3的启动子中可以被三种激素(包括GA、IAA以及6-BA)所诱导，但是并不能被ABA所诱导。通过将构建好的五个缺失启动子载体质粒进行基因枪轰击棉花胚珠，并对培养的胚珠长出纤维以后进行GUS染色，发现P3、P4和P5载体的纤维上面均有一定程度的GUS染色，从而再次证明GhRab11d3在纤维发育过程中发挥一定功能。

目录

声明

摘要

本文所用主要缩略词

第一章棉花纤维发育的研究进展

1棉花纤维细胞的四大发育过程

2棉花纤维发育相关基因的研究进展

第二章植物Rab类蛋白的研究进展

1 Rab蛋白的命名和分类

2 Rab蛋白的结构特点

3 Rab蛋白的功能

3．1 Rab蛋白在植物生长发育中的作用

3．2 Rab蛋白在生物和非生物胁迫中的作用

第三章植物启动子的研究进展

1植物启动子的一般结构

2植物启动子的一般类型

2．1组成型启动子

2．2特异型启动子

2．3诱导型启动子

3植物启动子的研究方法

3．1启动子缺失分析

3．2突变及获得或失去功能分析

3．3调控元件和结合蛋白互作分析

本研究的目的和意义

第四章雷蒙德氏棉Rab基因家族分析

1材料与方法

1．1数据库

1．2棉花中Rab蛋白的发掘

1．3棉花中Rab蛋白的基本生物信息学分析

1．4棉花中Rab蛋白的序列比对

1．5棉花中Rab蛋白的系统进化树的构建

1．6棉花中Rab蛋白的基因结构分析

1．7棉花中Rab蛋白的基因染色体分布分析

1．8棉花中Rab蛋白的RNAseq数据分析

2结果与分析

2．1雷蒙德氏棉中Rab基因家族成员的鉴定结果

2．2雷蒙德氏棉中Rab基因家族成员的命名

2．3雷蒙德氏棉中Rab基因家族成员的基本生物信息学分析

2．4雷蒙德氏棉中Rab基因家族成员的系统进化分析

2．5雷蒙德氏棉Rab基因家族成员的基因结构分析

2．6雷蒙德氏棉中Rab基因家族成员的染色体分布

2．7 Rab家族成员基因表达模式分析

3讨论

3．1雷蒙德氏棉中Rab蛋白基因家族成员的分类与基因结构基本具有一致性

3．2棉花中Rab蛋白基因家族成员的表达模式表明其功能的多样-眭

第五章陆地棉小G蛋白基因GhRab11d3的特征及功能分析

1．1植物材料

1．2菌株和质粒

1．3培养基的配置

1．4序列分析网站

1．5 DNA的提取

1．6荧光定量PCR分析

1．7 GhRab11d3基因组和cDNA序列的克隆

1．8亚细胞定位

1．8．1通过原生质体转化法观察亚细胞定位情况

1．9农杆菌介导的棉花遗传转化

1．10转基因植株的检测

1．11转基因植株的表达分析

1．12转基因植株的纤维品质检测

1．13酵母诱饵载体的构建以及棉纤维酵母文库的筛选

1．14双分子荧光互补BiFC的验证

1．15纤维中肌动蛋白细胞骨架的检测

1．16纤维中囊泡荧光染色和果胶含量的测定

2结果与分析

2．2 GhRab11d3的序列分析及遗传进化分析

2．3 GhRab11d3的原核表达分析

2．4 GhRab11d3在棉花不同组织中的表达分析

2．5 GhRab11d3的亚细胞定位

2．6转基因植株的获得

2．7转基因植株的PCR检测和转基因纯合株系的获得

2．8 GhRab11d3在转基因纯合株系中的表达分析

2．9 GhRab11d3在转基因纯合株系中的表型观察

2．10 GhRab11d3互作蛋白的发掘及验证

2．11棉纤维中囊泡荧光染色及果胶含量的测定

3讨论

3．3 GhRab11d3转基因材料的获得及对纤维长度的影响

3．4 GhRab11d3对于细胞骨架蛋白微丝F-actin及细胞壁组分果胶含量的影响

第六章陆地棉小G蛋白基因GhRab11d3启动子的特征及功能分析

1．1植物材料

1．2菌株和质粒

1．3培养基的配置

1．4启动子的克隆

1．5启动子的分析

1．6缺失启动子的载体构建

1．7农杆菌介导的烟草的稳定遗传转化

1．8转基因后代植株的PCR检测

1．9 GUS报告基因的定性检测

1．10烟草胚珠的外源激素诱导处理

1．11基因枪介导的融合载体在植物组织中的瞬时表达

2结果与分析

2．2 GhRab11d3启动子的克隆及序列分析

2．3 GhRab11d3启动子各缺失载体对烟草的遗传转化以及转基因后代纯系植株的获得

2．4 pGhRab11d3在烟草各组织器官中的功能分析

2．5pGhRab11d3的546 bp大小对于驱动GUS报告基因在烟草各组织器官中的表达是必须的

2．6pGhRab11d3可以被GA、IAA和6-BA所诱导，却不能被ABA所诱导

2．7 pGhRab11d3在纤维发育中的功能

3讨论

3．2 AGL15和MYB顺式作用元件可能是GhRab11d3启动子的核心调控元件

3．3 GhRab11d3启动子可以作为改良棉花纤维品质和增强激素应答的重要工具

全文结论

创新点

参考文献

附录

致谢

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