褐飞虱章鱼胺家族受体基因分析及药理学和生理功能研究

摘要

章鱼胺（Octopamine，OA）是无脊椎动物体内一种重要的生物胺，对应于脊椎动物体内的去甲肾上腺素，参与调控昆虫生长发育、取食、代谢等多种生理行为过程，并使昆虫以合理的方式来应对外界刺激。在昆虫体内，OA主要是通过结合特异性的章鱼胺受体(Octopamine receptors，OARs)来发挥作用。由于OA被认为主要是在无脊椎动物体内发挥重要功能，因此其所对应的受体被认为是新型杀虫剂开发的理想靶标而备受药理学家们关注。本研究中以农业害虫褐飞虱Nilaparvata lugens(St(a)l)为研究对象，克隆得到了褐飞虱OARs家族的6个基因序列，利用qPCR技术分析了这6个基因在褐飞虱不同发育阶段和成虫不同组织中的表达模式，通过体外真核表达研究了NlOA2B2型受体的药理学特性，包括激动剂和拮抗剂谱，并通过药理学和遗传学RNAi技术明确了NlOA2B2受体参与调控雌性褐飞虱产卵生理行为。 一、褐飞虱章鱼胺受体家族基因克隆及序列分析 通过将果蝇章鱼胺受体家族基因蛋白序列与褐飞虱基因组以及转录组数据进行TBLASTN比对分析后，我们鉴定并克隆到褐飞虱5种OA受体，将其分别命名为NlOA1、NlOA2B1、NlOA2B2、NlOA2B3、NlOA3(NlOA3-L和NlOA3-S)，受体NlOA3基因通过可变剪切产生了NlOA3-L和NlOA3-S两个转录本，在胞内三环上，NlOA3-L比NlOA3-S多8个氨基酸。跨膜域预测结果表明，这些受体具有G蛋白偶联受体(GPCRs)的典型特征，均存在7个跨膜域(TM1-TM7)、3个胞内环、3个胞外环、胞内C端和胞外N端。生物信息学分析表明，褐飞虱章鱼胺家族受体也存在在其他昆虫章鱼胺受体中被预测和证实的磷酸化位点、糖基化位点、棕榈酰化位点以及配体结合位点等保守的结构域。氨基酸同源性分析表明褐飞虱章鱼胺受体家族基因与其他昆虫同源基因之间的同源性非常高，同源性在50％～70％之间。基因结构分析表明，除未比对到完整基因组序列的NlOA1基因和未克隆到全长的NlOA2B3基因外，NlOA3基因的CDS区具有最多的外显子/内含子结构。 二、褐飞虱章鱼胺受体家族基因的表达模式分析 通过荧光定量PCR的方法，对褐飞虱体内克隆得到的6个章鱼胺受体基因进行表达模式分析。从研究结果可以看出，在褐飞虱不同的发育阶段中，NlOA1、NlOA2B1、NlOA2B2、NlOA2B3、NlOA3-L和NlOA3-S基因在整个发育周期中均可以检测到，其中，基因NlOA1、NlOA2B1、NlOA2B3、NlOA3-L和NlOA3-S在卵期及1-2龄的低龄若虫阶段表达水平较高，之后随着龄期发育均出现逐渐降低的趋势，成虫期最低，而在成虫阶段，雄虫体内的表达水平均高于雌虫，但NlOA2B2基因在卵期和低龄若虫阶段表达水平低于成虫阶段，在雄虫体内表达水平却是最高的。在褐飞虱成虫期不同组织中，6个基因均是在褐飞虱脑组织中表达水平最高，在肠、脂肪体、马氏管、血淋巴中的表达水平各不相同。NlOA1、NlOA2B1、NlOA2B3、NlOA3-L、NlOA3-S基因还存在于雌雄虫生殖器官中，NlOA2B2基因在褐飞虱足中的表达水平仅低于脑组织。NlOA2B2基因在褐飞虱生殖器官卵巢、输卵管、交配囊和受精囊中的表达模式研究发现，在卵巢中表达水平最低，输卵管、交配囊及受精囊三者之间的表达水平无差异。 三、褐飞虱NlOA2B2受体的药理学与生理学研究 我们使用稳定表达NlOA2B2基因的HEK293细胞系，采用ELISA法测定了章鱼胺(OA)、酪胺(Tyramine，TA)、多巴胺(Dopamine，DA)、5-羟色胺(Serotonin，5-HT)四种生物胺对胞内cAMP的影响。OA和TA均能诱导胞内产生cAMP，而DA和5-HT刺激均无此反应。OA和TA的EC50分别为1.14×10-7M和1.36×10-6M，OA的效力约为TA的8倍。因此，可推断出褐飞虱NlOA2B2是一种典型的章鱼胺受体并且偶联胞内cAMP的产生。此外，我们还测定了激动剂Naphazoline和Clonidine对胞内cAMP的效力，其EC50值分别为1.22×10-7M和6.03×10-7M。在拮抗剂试验中，Epinastine，Mianserin，Phentolamine，Methiothepin，Butaclamol，Methysergide可以显著地拮抗OA产生的效应，而Prazosin，Chlorpromazine和Ketanserin对OA无拮抗作用。 我们通过注射药物的方法来明确NlOA2B2是否参与调控褐飞虱的产卵行为，结果发现拮抗剂Epinastine和Phentolamine能显著降低褐飞虱的产卵量和产卵痕量，并且不影响褐飞虱的存活率。通过RNAi技术特异性的敲除NlOA2B2基因后，发现NlOA2B2基因在整头褐飞虱体内及输卵管中均能被沉默，免疫组化实验则进一步说明基因沉默使褐飞虱输卵管中的NlOA2B2蛋白信号明显减少。注射dsNloa2b2的褐飞虱的产卵量及产卵痕均比注射dsgfp的褐飞虱的低，并且注射dsNloa2b2并不影响褐飞虱的存活率。同时，我们解剖出注射过dsRNA产卵5天后褐飞虱的卵巢，发现NlOA2B2基因被沉默后会导致褐飞虱卵巢变大，并且卵巢中滞留了大量的卵，从而证明NlOA2B2基因在雌性褐飞虱的排卵行为中发挥重要作用。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1．褐飞虱概况

2．昆虫章鱼胺及其受体研究进展

2．1章鱼胺合成与代谢

2．2章鱼胺的分布及功能

2．3章鱼胺受体分类

2．4章鱼胺受体信号转导途径

2．5章鱼胺受体药理学

2．6章鱼胺受体生理功能

2．7章鱼胺受体作为杀虫剂靶标的作用机制

3．本研究的目的和意义

第二章褐飞虱章鱼胺家族受体基因克隆与序列分析

1．材料与方法

1．1供试昆虫

1．2主要试剂和仪器

1．3试验方法

2．结果与分析

2．1褐飞虱章鱼胺家族受体基因克隆及分类

2．2褐飞虱章鱼胺家族受体基因的分子特征及多重序列比对

2．3褐飞虱章鱼胺家族受体基因结构分析

2．4附图表

3．讨论

第三章褐飞虱章鱼胺家族受体基因表达模式分析

1．材料与方法

1．1供试昆虫

1．2主要试剂与仪器

1．3试验方法

2．结果与分析

2．2褐飞虱N1OA2B1受体基因表达模式分析

2．3褐飞虱N1OA2B2受体基因表达模式分析

2．4褐飞虱N1OA2B3受体基因表达模式分析

2．5褐飞虱N1OA3受体基因表达模式分析

3．讨论

第四章褐飞虱β-like-adrenergic OARs药理学与生理学研究

1．材料与方法

1．1供试昆虫

1．2主要试剂与仪器

1．3试验方法

2．结果与分析

2．1褐飞虱N1OA2B2的药理学性质

2．2注射拮抗剂对褐飞虱产卵行为的影响

2．3 dsRNA的干扰效率

2．4注射N1OA2B2基因dsRNA对褐飞虱产卵行为的影响

2．5褐飞虱雌虫产卵量下降的原因分析

3．讨论

全文总结

论文创新与不足

参考文献

附录

致谢