水稻转录因子RST1互作蛋白的鉴定及其耐盐功能分析

摘要

转录因子在水稻逆境胁迫应答过程中起到关键的作用，通过揭示转录因子在响应水稻盐胁迫中的作用机制及原理，随后通过基因工程手段改良水稻植物体中的相关基因，促使有效的耐盐基因发挥功能作用，从而达到提高水稻耐盐性的效果。目前已经克隆得到的水稻耐盐相关转录因子大概有30多个，这些基因在调节水稻不同发育时期的耐盐性方面，有着重要的作用。已知的转录因子有DREB，NAC，MYB，MYC，Cys2/His2zinc finger,bZIP,AP2/ERF,WRKY等几大家族。本论文以实验室前期分离鉴定得到的水稻耐盐突变体rst1为研究对象，利用酵母双杂交技术从水稻基因文库中筛选出与转录因子RST1互作的蛋白质，并构建相关的水稻转基因材料研究其基本生理特征及耐盐性，初步为研究突变体rst1的耐盐机理提供了参考依据。具体研究如下: 首先，本研究利用酵母双杂交技术从实验室构建好的水稻基因文库中筛选出与转录因子RST1有互作关系的蛋白质，经过回转验证，最终确定其中的三个阳性互作蛋白，包括CBSX3(CBS domain containing protein，CDCP)和热激蛋白Hsp40及一个未知蛋白。随后利用Pull-down技术和双分子荧光互补BiFC对其中一个重点研究的基因OsCBSX3进行后续的蛋白互作验证，进一步确定了其与RST1蛋白的阳性互作关系。并利用酵母双杂交技术进一步确定了RST1与CBSX3互作的蛋白结构域为N端和转录抑制结构域，推测CBSX3可能会影响RST1的转录调控活性和基因的转录水平，进而通过影响下游盐响应因子的表达水平来调控植物的耐盐性。随后，挑选了与RST1互作的其中两个基因CBSX3和Hsp40，构建了相关的水稻转基因植株，并对其耐盐性做了初步分析。 其次，本论文研究了互作蛋白CBSX3的定位情况，包括其在野生型水稻中的基因表达模式以及在烟草叶片和洋葱表皮中的亚细胞定位情况。实验结果表明，CBSX3主要定位在细胞核中，同转录因子RST1的核定位结果一致。野生型水稻中，转录因子CBSX3主要在地上部表达，且在叶片中表达量最高。随后，构建了OE-CBSX3水稻过表达株系和RNAi-CBSX3水稻基因沉默株系，其中过表达株系已收获到F1代种子，并对其进行了耐盐性分析。实验结果显示，用140mM NaCl处理OE-CBSX3过表达植株的三个line(L14、L17、L18)，均具有耐盐表型，地上部和地下部的Na+/K+比均显著低于野生型，表明CBSX3对RST1应该有负调控作用。定量分析表明OsCBSX3对盐和干旱均有响应，且与OsRST1对盐的响应模式大致相同，都在盐胁迫3hr时基因表达量上调最高。随后对OE-CBSX3的三个过表达株系进行定量分析，结果显示相比野生型，三个过表达株系中OsCBSX3的表达量均有显著性上调，而OsRST1的表达量均为显著性下降。表明基因OsCBSX3的过表达能在RNA水平下调OsRST1的表达量，进一步揭示了CBSX3和RST1可能的互作机理。此外，本论文初步研究了互作蛋白Hsp40的亚细胞定位和耐盐性分析。实验结果显示，Hsp40主要定位在内质网上，推测分子伴侣Hsp40可能影响RST1的蛋白质活性进而反馈调节转录因子RST1的转录水平。随后构建了OE-Hsp40水稻过表达株系，并对其初步进行了耐盐性分析。结果显示，用120mM NaCl处理OE-Hsp40过表达株系的三个不同line(L8、L9、L17)，均具有耐盐表型，说明Hsp40对RST1应该有负调控作用。定量分析表明，在野生型水稻中OsHsp40对盐和干旱胁迫都有响应。随后对OE-Hsp40的三个过表达株系进行定量分析，结果显示相比野生型，三个过表达株系中OsHsp40的表达量均有显著性上调，而OsRST1的表达量均有显著性下降。说明基因OsHsp40的过表达同样能在RNA水平下调OsRST1的表达量。但是，对于两个蛋白与RST1在蛋白水平的互作机理仍不清楚。 综上所述，本文利用了分子生物学、细胞生物学、生物化学等有关实验技术，筛选出了与RST1互作的蛋白质CBSX3和Hsp40，并对其组织表达模式及在细胞中的定位做了分析。通过对水稻转基因过表达株系的耐盐性进行分析，初步确定了CBSX3、Hsp40对RST1的负调控作用。

目录

声明

摘要

符号及缩略语表

绪论

第一章文献综述

1 植物的盐胁迫研究进展

1．1土壤盐渍化概述

1．2植物适应盐胁迫的机制

2转录因子与植物耐盐性

3转录因子的修饰

4研究目的及意义

第二章RST1互作蛋白的筛选及验证

1材料与方法

1．1实验材料

1．2 pGBKT7-RST1载体的构建

1．3酵母双杂交筛库

1．4互作验证

1．5酵母双杂交回转验证

1．6 Pull-down

1．7双分子荧光互补BiFC

2结果分析

2．1酵母双杂交筛库

2．2 回转验证(酵母双杂交)

2．3 Pull-down

2．4双分子荧光互补BiFC

3讨论

第三章RST1互作蛋白CBSX3的定位及其耐盐功能分析

1材料与方法

1．1实验材料

1．2 OsCBSX3的表达模式分析

1．3亚细胞定位

1．4水稻转基因材料构建

1．5野生型水稻的胁迫处理

1．6 OE-CBSX3过表达株系的盐处理

2结果分析

2．1 组织定位

2．2亚细胞定位

2．3 OsCBSX3对胁迫的响应

2．4 OE-CBSX3过表达株系的盐处理

3讨论

第四章RST1互作蛋白Hsp40的定位及其耐盐功能分析

1材料与方法

1．1 实验材料

1．2亚细胞定位

1．3 OE-Hsp40过表达株系的盐处理

2结果分析

2．1亚细胞定位

2．2 OsHsp40对胁迫的响应

2．3 OE-Hsp40过表达株系的盐处理

3讨论

全文结论和创新之处

参考文献

附录

致谢

学术成果目录