兔多杀性巴氏杆菌间接ELISA检测方法的建立及初步应用

摘要

兔多杀性巴氏杆菌病(Pasteurellosis)又称为兔出血性败血症(Hemorrhagic septicaemia，HS)是由兔多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，P.m)引起的一种急性、败血性传染病。在全球大多数国家和地区都有兔多杀性巴氏杆菌病的感染的报道，该病给家兔养殖业造成严重的经济损失。本研究用破碎后的兔多杀性巴氏杆菌作为抗原建立了一种检测兔多杀性巴氏杆菌抗体的间接ELISA方法，并运用该方法对临床生产中的血清样本进行检测，结果表明本研究所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、稳定性，可为兔多杀性巴氏杆菌病流行病调查和疫苗免疫提供有效的检测和监测工具。主要研究内容如下: 一、兔多杀性巴氏杆菌抗体检测间接ELISA方法的建立 本试验以破碎后的兔多杀性巴氏杆菌作为包被抗原，应用方阵法确定抗原包被浓度和血清稀释倍数，并对抗原包被时间、抗原封闭液、抗原封闭时间、血清孵育时间、二抗稀释倍数、二抗孵育时间、底物显示时间等试验条件进行了优化，建立了兔多杀性巴氏杆菌抗体检测ELISA方法，并对该方法的稳定性、特异性及酶标板的保存期进行了测定。结果显示，兔多杀性巴氏杆菌菌体破碎抗原的包被浓度为0.5μg/mL，血清稀释倍数为1∶100，抗原最佳包被时间为37℃2h，抗原最佳封闭液为5％脱脂乳，最佳封闭时间为3h，血清最佳孵育时间为60min，二抗最佳稀释倍数为1∶20000，二抗最佳孵育时间为1h，底物最佳显示时间为10min;确定了判定标准:阴阳性血清的临界值分别为0.227、0.277，当所测血清S/P值大于0.277时，确定为阳性;当所测血清S/P值小于0.227时，确定为阴性;当所测血清介两者之间时，确定为可疑;特异性试验结果显示，该ELISA酶标板不与兔支气管败血波氏杆菌、兔产气荚膜梭菌等细菌阳性血清反应，说明此方法具有良好的特异性;本试验方法稳定性良好;在不用防腐剂的情况下，酶标板的保存期可达到3个月。因此，本研究所建立的兔多杀性巴氏杆菌间接ELISA方法具有良好的特异性和稳定性，且操作简单，适于对大规模的临床血清样本进行检测，具有潜在的临床应用价值。 二、兔多杀性巴氏杆菌抗体检测间接ELISA检测方法的初步应用 本试验用建立的兔多杀性巴氏杆菌间接ELISA方法检测4个不同兔场家兔临床血清样本多杀性巴氏杆菌抗体的水平，并分析各兔场巴氏杆菌病流行情况;用建立的间接ELISA方法筛选用于免疫兔多杀性巴氏杆菌病相关疫苗的敏感家兔;用建立的ELISA方法检测经兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗免疫21天后的家兔血清，分析疫苗对免疫21天后家兔的保护效果与多杀性巴氏杆菌抗体的关系;用建立的ELISA方法检测经兔多杀性巴氏杆菌病灭活苗免疫后免疫期的家兔血清，分析多杀性巴氏杆菌抗体在不同时期的变化情况。试验结果表明，4个不同兔场家兔临床血清样本多杀性巴氏杆菌抗体的阳性率不同，安徽滁州市某兔场家兔血清阳性率最高(38.89％)，句容市黄梅镇某兔场家兔血清阳性率最低(8.82％)，南京某兔场A、南京某兔场B家兔血清阳性率分别为18.39％、20.39％;经单苗免疫21天的家兔攻毒后死亡率明显低于对照组，免疫组家兔血清为阳性的存活率约为80％;在疫苗免疫期内，免疫组家兔在疫苗免疫后1个月抗体水平由0.15左右上升到0.45左右，在此后的6个月，抗体均维持在0.45左右，抗体变化没有明显的规律;对照组家兔抗体水平变化不明显，均维持在0.15左右，各个测定时间点免疫组抗体水平明显高于对照组，家兔经不同批次兔多杀性巴氏杆菌病灭活疫苗免疫后，体内产生保护性抗体的变化规律较为一致。结果表明本研究所建立的间接ELISA方法可用于家兔巴氏杆菌病流行病学调查，并在疫苗效力检验方面也具有潜在的应用价值。

目录

声明

摘要

符号及缩略语

绪论

第一章多杀性巴氏杆菌研究进展

1 多杀性巴氏杆菌的生物学特性

1．1菌体的形态结构及其染色特性

1．2细菌的培养及理化特性

1．3细菌的耐受性

2多杀性巴氏杆菌的血清学分型方法

3 多杀性巴氏杆菌主要的毒力因子

3．1 外膜蛋白

3．2脂多糖

3．3荚膜多糖

3．4铁调控和获取蛋白

3．5皮肤坏死素

3．6黏附素

4多杀性巴氏杆菌病的流行与危害

5兔多杀性巴氏杆菌病的临床症状及病理变化

5．1 临床症状

5．2病理变化

6多杀性巴氏杆菌的诊断方法

6．1临床诊断

6．2实验室检测

6．3分子生物学诊断

7多杀性巴氏杆菌疫苗的研究进展

7．1全菌疫苗

7．2亚单位疫苗

7．3重组疫苗

7．4 DNA疫苗

第二章兔多杀性巴氏杆菌抗体检测间接ELISA方法的建立

1试验材料

1．1菌株

1．2主要仪器设备

1．3主要试剂

1．4其他试验材料

2方法

2．1抗原的制备

2．2间接ELISA检测方法的建立

2．3间接ELISA最佳试验条件的筛选

2．4间接ELISA方法阴阳性判定标准的确定

2．5间接ELISA特异性试验

2．6抗原稳定性试验

2．7抗原包被酶标板保存期试验

3试验结果

3．1间接ELISA的最佳试验条件

3．2间接ELISA阴、阳性判定标准的建立

3．3间接ELISA特异性试验

3．4稳定试验

3．5保存期试验结果

4讨论

参考文献

第三章兔多杀性巴氏杆菌抗体检测间接ELISA方法的初步应用

1 材料

1．1菌株

1．2试验动物

1．3主要仪器设备

1．4主要试剂

1．5其他试验材料

2方法

2．1酶标检测板的制备

2．2兔临床血清样本的采集和处理

2．3间接ELISA检测方法的步骤

2．5用建立的方法筛选疫苗免疫敏感家兔

2．6用建立的方法检测疫苗效力试验家兔血清

2．7用建立的方法检测疫苗免疫期家兔血清

3 结果

3．1不同兔场临床血清样本检测

3．2用建立的方法筛选疫苗免疫用敏感家兔

3．3用建立的方法检测疫苗效力试验家兔血清

3．4用建立的方法检测疫苗免疫期家兔血清

4讨论

参考文献

结论

附录：常用试剂的配制

致谢