磷酸盐对莱茵衣藻砷的耐性和形态转化的影响研究

摘要

砷(As)是一种广泛分布于海洋、淡水和土壤环境中的有毒类金属。由于自然和人为因素，大量含砷化合物进入环境，最终随河流从陆地迁移到海洋，导致海洋生态系统砷污染日益严重。微藻作为海洋和淡水生态系统中的初级生产者，具有很强的砷富集能力，并能介导砷形态的转化，在砷的生物地球化学循环中具有不可忽视的作用。已有研究表明，莱茵衣藻对砷有较强的富集能力，具备水体砷污染修复的潜力，然而有关磷酸盐(PO43-)对莱茵衣藻砷耐性和形态转化的影响还没有系统的研究。因此，本文首先探讨了胞内砷磷含量和比值对莱茵衣藻砷酸盐(As(Ⅴ))和亚砷酸盐(As(Ⅲ))耐性的影响;然后比较了不同PO43-水平下，莱茵衣藻野生型和缺失砷酸盐还原酶基因及亚砷酸盐外排基因的突变体对As(Ⅴ)吸收和转化的差异，并研究了不同藻种砷酸盐还原酶活性及其基因的表达，及其与As形态和胞内磷含量的关系。本文主要研究结果如下: 1.胞内砷磷含量和比值对莱茵衣藻As(Ⅴ)和As(Ⅲ)耐性的影响 通过设置两个PO43-和系列As(Ⅴ)、As(Ⅲ)浓度，对莱茵衣藻进行72h生长抑制毒性试验，探索了培养液和藻细胞P含量对As(Ⅴ)和As(Ⅲ)的吸收和毒性的影响。 结果表明，在两种PO43-水平(0.315、3.15mg·L-1)下的As(Ⅲ)-EC50(2090.3、21183.6μg-As/L)明显高于As(Ⅴ)-EC50(162.1、2358.3μg-As/L)，说明莱茵衣藻对As(Ⅲ)有较强的耐性，而对As(Ⅴ)比较敏感。提高培养液PO43-浓度不影响As(Ⅲ)处理下的胞内As含量([As]intra)，但显著降低了As(Ⅴ)处理下的[As]intra，因此当以[As]intra推算EC50时，PO43-水平不影响As(Ⅲ)-EC50(123.9、125.0μg-As/g-dw)，但显著影响As(Ⅴ)-EC50(7.4、58.6μg-As/g-dw)。以藻胞内As、P含量比值([As∶P]intra)推算的EC50结果显示，培养液PO43-对两种As形态的毒性影响相反，As(Ⅲ)-EC50分别为21.1、6.1mol-As/mol-P，As(Ⅴ)-EC50分别为1.3、3.4mol-As/mol-P。上述结果说明，As(Ⅴ)对该藻的毒性大于As(Ⅲ)，莱茵衣藻对As(Ⅴ)和As(Ⅲ)的耐性除了受到培养液PO43-浓度的制约外，还受到胞内As、P含量及其比值的影响。 2.不同磷酸盐水平对莱茵衣藻砷酸盐代谢的影响 研究了在不同PO43-水平(0.315、3.15mg·L-1)下莱茵衣藻野生型和缺失砷酸盐还原酶基因及亚砷酸盐外排基因的突变体对As(Ⅴ)吸收、形态转化的动态变化规律。 结果表明，在缺磷状态下，更有利于莱茵衣藻对As(Ⅴ)的吸收、富集，并能使更多的As(Ⅴ)还原为As(Ⅲ)。不同PO43-水平下莱茵衣藻对As(Ⅴ)的吸收、还原能力、速率以及As(Ⅲ)的外排速率不同。胞内As(Ⅴ)还原、As(Ⅲ)外排是莱茵衣藻对As(Ⅴ)的主要解毒途径。与野生型WT相比，缺失亚砷酸盐外排基因arsB的突变体△arsB对As(Ⅴ)的吸收、还原以及As(Ⅲ)的外排速率几乎相同，然而缺失砷酸盐还原酶基因HAC、ACR2的突变体△HAC-1、△HAC-2和△ACR2.1、△ACR2.2-1、△ACR2.2-2胞内As(Ⅴ)还原能力以及As的吸收富集能力显著降低，说明砷酸盐还原酶基因在调控As(Ⅴ)还原过程中起重要作用，相比于基因ACR2.2，基因ACR2.1的作用更大。 3.不同磷酸盐水平下莱茵衣藻砷酸盐还原酶活性及基因的表达 基于上述实验结果，研究不同磷酸盐水平下野生型WT和缺失砷酸盐还原酶基因ACR2的突变体的砷酸盐还原酶活性及ACR2.1、ACR2.2基因的相对表达水平。 结果表明，As(Ⅴ)处理显著提高砷酸盐还原酶活性，并且缺磷状态也能增加砷酸盐还原酶活性。砷酸盐还原酶基因ACR2.1、ACR2.2的表达在莱茵衣藻As(Ⅴ)还原过程中的起着重要作用，缺磷均能使基因ACR2.1、ACR2.2的表达上调，对比ACR2.2，ACR2.1表现出更强的As(Ⅴ)还原能力。 综上所述，本文系统探讨了不同磷水平下莱茵衣藻对砷酸盐的代谢过程，阐明了胞内砷磷含量和比值对莱茵衣藻As(Ⅴ)和As(Ⅲ)耐性的影响，以及不同磷酸盐水平下莱茵衣藻对砷酸盐吸收、形态转化的规律，结果发现亚砷酸盐外排基因arsB并不是调控As(Ⅲ)外排的关键基因;相比砷酸盐还原酶基因HAC，ACR2在As(Ⅴ)还原过程中作用更大，同时证实了砷酸盐还原酶基因ACR2.1、ACR2.2在As(Ⅴ)还原过程中的表达并受到培养液中PO43-调控，且ACR2.1比ACR2.2表现出更强的As(Ⅴ)还原能力。

目录

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论文说明

摘要

缩略词

第一章文献综述

1．1近岸海域砷污染现状

1．2砷的概况

1．2．1砷的性质和形态及含量

1．2．2砷的来源

1．2．3砷的毒性危害

1．3砷的生物修复

1．4微藻对砷的生物转化

1．4．1 As(Ⅴ)的还原

1．4．2 As(Ⅲ)的氧化

1．4．3 As的甲基化

1．4．4 As的外排

1．4．5 As与胞内巯基物质的络合

1．5磷酸盐对微藻砷转化的影响

1．6莱茵衣藻砷代谢研究进展

1．7研究内容、目的意义及技术路线

1．7．1研究内容

1．7．2研究目的和意义

1．7．3技术路线

第二章胞内砷磷含量和比值对莱茵衣藻砷酸盐和亚砷酸盐耐性的影响

2．1材料与方法

2．1．1实验材料

2．1．2莱茵衣藻的无菌纯化

2．1．3实验方法

2．1．4数据分析

2．2结果与分析

2．2．2 As(Ⅴ)对莱茵衣藻的毒性

2．2．3 As(Ⅲ)与As(Ⅴ)对莱茵衣藻砷毒性的差异

2．3讨论

2．3．2不同磷酸盐水平下As(Ⅴ)对莱茵衣藻的毒性

2．4小结

第三章不同磷酸盐水平对莱茵衣藻砷酸盐代谢的影响

3．1材料与方法

3．1．1实验材料

3．1．2莱茵衣藻野生型和突变株的无菌纯化

3．1．4测定方法

3．2结果与分析

3．2．1 不同磷酸盐水平下As(Ⅴ)处理对莱茵衣藻生长的影响

3．2．2不同磷酸盐水平对莱茵衣藻As(Ⅴ)的吸收和富集影响

3．2．3不同磷酸盐水平下As(Ⅴ)处理对莱茵衣藻胞内砷形态转化的影响

3．2．4不同磷酸盐水平下As(Ⅴ)处理对培养液中砷形态转化的影响

3．3讨论

3．3．2不同磷酸盐水平对莱茵衣藻As(Ⅴ)形态转化的影响

3．4 小结

第四章不同磷酸盐水平下莱茵衣藻砷酸盐还原酶活性及基因的表达

4．1材料与方法

4．1．1实验材料

4．1．2实验方法

4．1．3测定方法

4．1．4数据处理

4．2结果与分析

4．2．1 莱茵衣藻砷酸盐还原酶活性

4．2．2莱茵衣藻砷酸盐还原酶基因的相对表达水平

4．3讨论

4．4小结

第五章全文总结与展望

5．1 全文总结

5．1．1 胞内砷磷含量和比值对莱茵衣藻砷酸盐和亚砷酸盐耐性的影响

5．1．2不同磷酸盐水平对莱茵衣藻砷酸盐代谢的影响

5．1．3不同磷酸盐水平下莱茵衣藻砷酸盐还原酶活性及基因的表达

5．2创新之处

5．3研究展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文