假单胞菌属植物病原菌DNA条形码检测技术研究

摘要

假单胞菌属(Pseudomonas)是一类分布较为广泛且种类较多的细菌。该属下既有存在于植物叶片上的无害共生菌，也有侵染植物的植物病原细菌。假单胞菌属分类体系庞大而复杂，且随着分类鉴定技术的发展该属下细菌分类情况又会出现变动，这些均为该属细菌的快速准确检测鉴定带来了难度。同时，在中国检疫性有害生物名录中隶属于假单胞菌属的植物病原细菌就有六种，且均是以致病变种水平进行区分，因此探究如何快速高效的对假单胞菌属、种及致病变种进行检测鉴定有着非常重要的意义。DNA条形码技术作为一种将分子生物学同生物信息学有机结合的检测技术，为假单胞菌属细菌快速准确检测鉴定提供了思路。 为筛选DNA条形码技术应用时所需的DNA条形码基因，特选取了假单胞菌属分类鉴定研究中常用的八个基因:16S rRNA、rpoD、gyrB、cpn60、gltA、gapA、cts和pgi对从各菌种库购买或使用实验室分离得到并准确鉴定后的共107株假单胞菌进行扩增测序，并对各基因所得序列进行扩增率、测序成功率计算，NJ进化树分析，种内种间遗传距离分析，Wilcoxon秩和检验分析以及Barcoding gap计算等比较评价这八个基因对假单胞菌的区分能力。结果表明rpoD和gapA基因均能有效将大多数假单胞菌致病变种进行鉴别，同时本研究还根据这两个基因的区分能力初步建立了利用DNA条形码技术快速准确实现假单胞菌属非特异性鉴定的有效方法。 植物病原性假单胞菌除了六类检疫性致病变种需要重点关注外，还有一些其他的致病变种由于为农业生产带来巨大损失而同样需要格外关注，黄瓜细菌性角斑病菌Pseudomonas syringae pv.lachrymans便属于后者。黄瓜细菌性角斑病菌是一类侵染黄瓜的植物病原细菌，其引发的病害在中国多地区普遍发生，带来严重的损失。对于该病害的快速检测，虽然可以通过DNA条形码技术来实现，但是当检测中确定该病菌为目标菌时，使用特异性的检测方法则会更加的高效准确。数字PCR作为一种新兴的定量PCR技术，目前在医学检测、基因检测中得到较为广泛的运用，在植物病原细菌的特异性检测方面也拥有着巨大前景。本实验为探究数字PCR对P.syringae pv.lachrymans特异性检测的可行性与适用性，特使用该病原细菌特异性引物探针结合数字PCR进行特异性检测和灵敏度检测。结果表明，使用数字PCR技术可以特异性的检测P.syringae pv.lachrymans并且可以检测浓度大于2.4×10-4ng/μl的阳性DNA模板。这都说明利用数字PCR技术可以有效地、高灵敏度地对黄瓜细菌性角斑病菌P.yringae pv.lachryman进行特异性检溅。

目录

声明

摘要

第一部分文献综述

第一章假单胞菌属概述

1假单胞菌属分类情况

2中国检疫性假单胞菌概述

第二章植物病原细菌检测鉴定方法

1植物病原细菌的鉴定

2植物病原细菌的检测

第三章DNA条形码技术

2植物病原细菌检测鉴定中常用筛选基因概述

3常用DNA条形码数据库概述

第四章数字PCR技术

1．数字PCR技术原理

2．数字PCR研究进展

第二部分研究内容

第一章假单胞菌属DNA条形码基因筛选与评价

1材料与方法

2结果与分析

3总结与讨论

第二章黄瓜细菌性角斑病数字PCR检测

1材料与方法

2结果与分析

3总结与讨论

参考文献

致谢

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