鲤鱼两种脂酰辅酶A脱氢酶基因cDNA克隆、表达及蛋白活性分析

摘要

脂肪是生物体重要的有机储能物质，其分解产物脂肪酸又是生物体重要的结构物质和活性物质。脂肪酸的氧化是动物、许多原生物及一些细菌获得能量的主要代谢途径，脂酰辅酶A脱氢酶对脂肪酸β氧化起主要的调控作用，是催化中链和长链脂肪酸第一步脱氢反应的关键酶，而中链脂酰辅酶A脱氢酶(medium-chain Acyl-CoA dehydrogenase，MCAD)和长链脂酰辅酶A脱氢酶(long-chain Acyl-CoA dehydrogenase，LCAD)是脂酰辅酶A脱氢酶家族中重要的两种。目前对于鲤鱼MCAD和LCAD结构及功能方面的研究鲜少报道，本文克隆了鲤鱼MCAD和LCAD，测定了他们的组织表达水平及其不同脂肪源对其表达的影响，构建了MCAD-pEASY(E2)和LCAD-pEASY(E2)原核表达载体，测定了原核表达蛋白的酶活。 使用TRIzol法提取了鲤鱼(Cyprinus carpio)肝脏总RNA，将RNA反转录为cDNA，设计引物，以cDNA为模板，PCR扩增克隆了鲤鱼脂酰辅酶A脱氢酶家族中的MCAD和LCAD基因。MCAD和LCAD基因开放阅读框分别为1275bp和1326bp，编码的氨基酸分别为424和441个，具备ACADs家族的特征序列，包括FAD结合位点、底物结合位点、催化位点等，与斑马鱼同源性很高，蛋白一致性分别为93.16％和94.56％。系统进化分析表明，鲤鱼MCAD和LCAD与不同纲动物的MCAD和LCAD之间的遗传距离与分类地位基本一致。 实时定量RT-PCR结果表明，MCAD和LCAD主要在肝脏和心脏表达;不同脂肪源对MCAD的表达没有明显影响，但鱼油对LCAD的表达有明显的刺激作用。本研究结果表明与哺乳动物类似，鲤鱼MCAD和LCAD在肝脏和心脏表达量高;高不饱和脂肪酸对LCAD的表达有促进作用。 构建的原核表达载体MCAD-pEASY(E2)和LCAD-pEASY(E2)，经IPTG诱导，在Transetta(DE3)细胞中表达了分子量分别为43KDa和43.6kDa的融合蛋白。经检测这两个蛋白均能自然结合FAD辅基，具有ACADs家族的特征结构。利用酶标仪在200-600nm波长下进行FAD辅基装载的检测，结果显示，在370nm、450nm有明显的蛋白吸收峰，表明MCAD和LCAD FAD辅基均装载成功。MCAD和LCAD原核表达蛋白成功地在大肠杆菌中表达且使用Ni柱纯化获得了高浓度的纯化蛋白。使用对吩嚓硫酸甲酯反应法测定了MCAD和LCAD酶活，酶活性测定结果表明:MCAD和LCAD酶活性最适温度均为28℃，此时酶活分别为9.12U/g、10.29U/g。本实验为进一步对鲤鱼ACADs的研究以及改善饲料配方提供了依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

绪论

第一章文献综述

2脂肪酸β氧化简介

3脂酰辅酶A脱氢酶(Acyl-CoA dehydrogenases，ACADs)

3．1脂酰辅酶A脱氢酶简介

3．2脂酰辅酶A脱氢酶的发现

3．3脂酰辅酶A脱氢酶的分类

3．4脂酰辅酶A脱氢酶基因的结构和性质

3．5脂酰辅酶A脱氢酶研究进展

3．5脂酰辅酶A脱氢酶缺乏和治疗

4课题研究的目的与内容

第二章两种鲤鱼脂酰辅酶A脱氢酶基因的cDNA克隆及表达

1材料与方法

1．1实验用鱼

1．2实验仪器

1．3实验试剂

1．4引物

1．5 RNA提取及cDNA合成

1．6鲤鱼MCAD、LCAD基因编码区cDNA序列克隆

1．7序列分析及遗传进化分析

1．8 MCAD和LCAD mRNA组织表达测定

1．9不同脂肪源条件下mRNA组织表达测定

2实验结果

2．1鲤鱼ACADs基因序列及其结构分析

2．2遗传进化分析

2．3组织表达分析

2．4不同脂肪源对MCAD和LCAD表达的影响

3讨论

第三章鲤鱼MCAD和LCAD的原核表达及蛋白纯化

1材料与方法

1．1实验材料

1．2实验试剂

1．3重组质粒ACADs-pEASY-E2的构建及鉴定

1．4重组质粒ACADs-pEASY-E2的原核表达

1．5蛋白纯化

2实验结果

2．2重组质粒ACADs-pEASY-E2的原核表达

2．3融合蛋白ACADs的纯化及其鉴定

2．4 BCA蛋白浓度测定

3讨论

第四章鲤鱼MCAD和LCAD催化活性测定和分析

1材料与方法

1．1实验试剂及仪器

1．2检测ACADs中FAD辅基装载

1．3蛋白活性的测定方法

1．4 ACADs在不同温度下的酶活

2实验结果

2．1 MCAD、LCAD的FAD辅基装载检测

2．2温度对MCAD、LCAD酶活的影响

3讨论

全文总结

参考文献

附录

致谢

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