猪肺炎支原体血清抗体与黏膜抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

摘要

猪支原体肺炎(Mycoplasma hyopneumoniae of swine，MPS)是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种以高发病率、低死亡率为特点的慢性呼吸道传染病。感染该病后，呼吸系统的免疫能力遭到破坏，使机体容易继发感染其他危害较大的呼吸道疾病，严重影响养猪业的健康发展。初期常常呈现非典型性、慢性感染，不易察觉。猪群一旦感染，则净化难度较大。因此，对该病进行及时、准确的诊断就显得尤为重要。现阶段中国主要使用ELISA和PCR技术对该病进行检测，耗时较长，对操作人员的专业能力和仪器设备要求较高，不利于临床推广。胶体金免疫层析检测技术(Colloidal gold immunochromatographic assay,GICA)应运而生，该技术具有快速、简便、灵敏、廉价的特点，方便临床上对该病进行快速诊断。因此，本试验通过制备纯度较高的Mhp优势抗原P97R1和P46，建立Mhp抗体胶体金免疫层析检测方法。研究结果如下: 1.根据文献资料，对重组大肠杆菌进行诱导，表达Mhp的特异性抗原P97R1和P46，并通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化。然后通过柠檬酸三钠还原法制备浓度为0.02％，粒径在20～30nm的胶体金颗粒，将P97R1和P46蛋白分别标记到胶体金上，制备两种免疫胶体金溶液。结果显示，获得了纯度较高的P97R1和P46蛋白，Western blot显示抗原性较好。所制备的免疫胶体金溶液进行试纸条层析鉴定后，可用于胶体金免疫层析试纸条的制备。 2.通过筛选最适胶体金层析试纸的组合方案，进而对试纸条进行优化，建立免疫胶体金层析法检测猪血清中的Mhp抗体。试验结果证明，该试纸条5～10min即可获得检测结果，灵敏性高，特异性和重复性都较好，对76份临床样品的检测结果显示，与商品化ELISA检测试剂盒符合率达到96.1％，可用于临床上的快速检测。 3.在建立的Mhp血清抗体免疫胶体金层析检测方法的基础上，通过筛选最适胶体金层析试纸条的组合方案，并对试纸条进行优化，建立免疫胶体金层析法检测鼻拭子样品和支气管肺泡灌洗液样品中的Mhp特异性sIgA。试验结果显示，该试纸条5～10min即可获得检测结果，与实验室自制的ELISA检测方法符合率达87.5％，特异性有待提高。

目录

声明

摘要

缩略语及符号

绪论

第一篇文献综述

1 猪肺炎支原体的研究进展

1．1病原学

1．2猪肺炎支原体的致病机理

2猪肺炎支原体的主要抗原蛋白

2．1黏附因子

2．2膜蛋白

2．3细胞质蛋白

3猪肺炎支原体的检测技术

3．1临床与病理剖检

3．2 PCR诊断技术

3．3血清学检测

4胶体金免疫层析技术

4．1胶体金发展历程

4．2胶体金的特性和制备

4．3免疫胶体金的制备及层析原理

4．4免疫胶体金层析技术在动物疾病诊断上的应用

第二篇研究内容

第一章免疫胶体金的制备

1材料

2方法

3实验结果

4分析与讨论

参考文献

第二章猪肺炎支原体血清抗体胶体金免疫层析检测方法的建立

1材料

2方法

3结果

4分析与讨论

参考文献

第三章猪肺炎支原体黏膜抗体免疫胶体金层析检测方法的建立

1材料

2方法

3结果

4分析与讨论

参考文献

结论与展望

附录

致谢