猪胃CaSR对蛋白质及芳香族氨基酸的感应规律及机制研究

摘要

日粮中的蛋白质作为三大能源物质之一，是生命的物质基础和生命活动的主要承担者。蛋白质经动物胃肠道消化，降解为肽或氨基酸，不仅能被机体作为营养物质进行吸收，也是重要的信号分子，激活胃肠道中各种感应体或转运体，对包括肠上皮细胞的增殖分化、胃液及胃肠激素的分泌、营养物质的消化吸收等进行调控，进而调节胃肠道的生理功能。钙离子敏感受体(Calcium sensing receptor，CaSR)是G蛋白偶联受体C家族中一员，它在整个胃肠道有广泛表达，特别是胃中，在胃基底膜外侧以及胃窦内分泌细胞（G细胞和D细胞）均有表达。有研究显示，芳香族氨基酸如苯丙氨酸(L-phenylalanine，Phe)、色氨酸（L-tryptophan，Trp）可以激活胃中的CaSR，调控H+-K+-ATP酶及胃泌素的释放，从而影响胃酸的分泌。但是，目前关于氨基酸和蛋白质影响胃CaSR表达及其功能的研究主要集中在人和啮齿类动物，家畜尤其是猪胃还未见报道。目前，猪胃组织是否有CaSR表达，其是否能够介导氨基酸对胃功能性酶和胃肠激素分泌进行调控尚不清楚。为此，本论文分别设计了体内和体外两部分试验对上述一系列问题展开研究。 1不同蛋白质水平饲粮对猪胃肠道CaSR表达、胃肠激素及胃相关指标的影响 研究给猪饲喂不同蛋白质水平饲粮对猪胃肠激素分泌及胃功能相关指标（H+-K+-ATP酶、胃蛋白酶）、胃肠道钙敏感受体(Calcium-sensing receptor，CaSR)基因表达的影响，探讨蛋白质水平与CaSR基因表达、胃肠激素分泌及胃功能相关指标的关系。选择健康、体重相近（9.57±0.64）kg的“杜×长×大“杂交断奶仔猪18头，随机分为3组，每组6头，单栏饲养，以玉米-豆粕型饲粮为基础，根据猪不同生长阶段的营养需要，仔猪阶段饲喂饲粮粗蛋白质水平为20％（NRC标准）、17％、14％，生长阶段饲粮粗蛋白质水平为18％（NRC标准）、15％、12％，肥育阶段饲粮粗蛋白质水平为16％（NRC标准）、13％、10％的饲粮，饲养期为125d，试验结束后屠宰，采集前腔静脉血液、胃肠道各部位组织、粘膜及食糜，测定血液中胃肠激素水平、胃功能相关酶活性及胃肠道各部位中CaSR的表达。结果表明，胃CaSR表达随饲粮蛋白质水平下降而显著升高(P＜0.05)，十二指肠、空肠CaSR基因表达均显著降低（P＜0.05）。当饲粮蛋白质降低时，除胆囊收缩素(CCK)在蛋白质降低3％时显著升高外，葡萄糖促胰岛素肽(GIP)、酪酪肽(PYY)均显著降低（P＜0.05），而胃蛋白酶及H+-K+-ATP酶活性显著升高;胃肠道中CaSR基因表达与胃蛋白酶、H+-K+-ATP酶活性及GIP、PYY呈显著正相关性。说明，饲粮蛋白质水平降低影响猪胃肠道CaSR基因的表达，从而影响猪部分胃肠激素的浓度及胃功能性指标。 2CaSR介导苯丙氨酸调控猪胃H+-K+-ATP酶活性、胃肠激素分泌规律及其机制研究 本试验以猪胃为材料，利用体外表面灌流系统，通过分别添加不同浓度苯丙氨酸、CaSR激活剂、抑制剂、[Ca2+]e、IP3R抑制剂，收集灌流液及组织，测定激素浓度、H+-K+-ATP酶活性和CaSR基因表达，研究苯丙氨酸是否通过CaSR介导影响猪胃窦胃肠激素、胃底H+-K+ATP酶的分泌及其发挥作用的信号机制。结果发现，80mM苯丙氨酸及CaSR激活剂cinacalcet显著促进生长抑素(SS)、胃泌素(gastrin)的分泌及H+-K+ATP酶活性，显著上调CaSR基因的表达（P＜0.05）;CaSR特异性拮抗剂NPS2143显著抑制苯丙氨酸引起的SS、gastrin分泌及其H+-K+ATP酶活性（P＜0.05），显著下调苯丙氨酸诱导的CaSR基因表达(P＜0.05)。Ca2+是CaSR的天然性配体，其可以显著促进苯丙氨酸诱导的胃肠激素分泌和H+-K+ATP酶活性(P＜0.05)，上调CaSR的基因表达(P＜0.05)。2-APB是CaSR介导的下游信号通路信号点IP3受体抑制剂，其显著抑制苯丙氨酸引起SS，gastrin的分泌(P＜0.05)。综上所述，苯丙氨酸对猪胃底H+-K+ATP酶活性，胃窦分泌激素具有促分泌作用，这种作用是通过激活CaSR，进而启动G蛋白偶联的信号转导，激活IP3实现。 3CaSR介导色氨酸调控猪胃H+-K+-ATP酶活性、胃肠激素分泌规律及其机制研究 本试验利用体外表面灌流系统灌流猪的胃窦及胃底，通过分别添加不同浓度色氨酸、CaSR激活剂、抑制剂、[Ca2+]e、IP3R抑制剂，收集灌流液及组织，测定激素浓度、H+-K+-ATP酶活性和CaSR基因表达，探讨CaSR是否介导色氨酸影响猪胃底H+-K+-ATP酶活性以及胃窦胃肠激素的分泌及内在机制。结果发现，20、50mM色氨酸和CaSR激活剂cinacalcet显著促进胃底H+-K+-ATP酶活性以及胃窦SS、gastrin的分泌(P＜0.05)，显著上调CaSR的基因表达（P＜0.05）;NPS2143是CaSR的特异性拮抗剂，显著抑制色氨酸引起的胃底H+-K+-ATP酶活性以及胃窦SS、gastrin的分泌(P＜0.05)，下调CaSR基因表达(P＜0.05);而Ca2+是CaSR的天然性配体，可显著促进色氨酸引起H+-K+-ATP酶活性以及SS、gastrin的分泌(P＜0.05)，上调色氨酸诱导的CaSR基因表达（P＜0.05）;2-APB是IP3受体特异性抑制剂，其显著抑制了色氨酸引起的胃窦SS、gastrin的分泌(P＜0.05)。说明，色氨酸可以促进猪胃底H+-K+-ATP酶活性以及胃胃肠激素的分泌，这种促分泌作用可能是通过激活CaSR，启动G蛋白偶联的下游信号转导，活化IP3受体，促进IP3与IP3R的结合实现的。

目录

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论文说明

摘要

中英文缩略词对照表

引言

第一章文献综述

1 胃肠道内分泌系统

2钙敏感受体(CaSR)

3钙敏感受体(CaSR)在胃肠道中的作用

4 Ca2+对CaSR的作用

5 CaSR介导胃肠激素分泌、H+-K+-ATP酶活性的作用及其机制

5．1对胃肠激素分泌的调节

5．2对胃中H--K--ATP酶活性的调节

6现在研究中存在的问题及本研究的目的、意义和主要内容

6．1现有研究存在的问题

6．2本研究目的和意义

6．3研究内容

6．4研究的主要技术路线

第二章不同蛋白质水平饲粮对猪胃肠道CaSR表达、胃肠激素及胃相关指标的影响

1材料和方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第三章CaSR介导苯丙氨酸调控猪胃H+-K+-ATP酶活性、激素分泌的规律及其机制研究

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

4小结

参考文献

第四章CaSR介导色调控猪胃H+-K+-ATP酶活性、胃肠激素分泌规律及其机制研究

1材料和方法

2结果与分析

3讨论

4小结

参考文献

全文结论

本研究创新点

致谢

攻读学位期间发表的学术论文和获得的专利