禽源大肠杆菌噬菌体的特性研究及噬菌体受体相关基因的筛选

摘要

禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia.coli，APEC)是一种感染后引起鸡、火鸡及其他禽类局部或全身性感染的肠道外致病性大肠杆菌，该病原主要引起呼吸道感染、多发性浆膜炎、心包炎、气囊炎、败血症等严重的肠道外感染，给世界范围内的养禽业带来巨大的经济损失。本次实验中，一共分离到75株禽致病性大肠杆菌噬菌体，对其中的部分噬菌体做了生物学特性分析。筛选出一株温和噬菌体P88，对其进行基因组测序，比较基因组分析，以及改造尾丝蛋白的初步探索等实验研究。并且利用Tn5转座子插入突变技术，以APEC菌株XM和T4-like噬菌体QL01来筛选与噬菌体受体相关的基因，并利用无痕缺失同源重组技术，构建三株缺失株，为探索烈性噬菌体的受体和噬菌体侵染大肠杆菌的机制提供了新的思路。 1.禽源大肠杆菌噬菌体的分离纯化及生物学特性分析 本试验从南京某地区菜市场采集多份鸭粪样品，利用双层平板法来分离纯化噬菌体。实验中一共得到75株禽致病性大肠杆菌噬菌体。通过测定宿主谱发现，不同噬菌体可以裂解2-29株细菌。对其中的部分噬菌体做了热稳定性、最佳感染复数等生物学特性分析。选取了11株噬菌体，在不同的培养温度和培养时间的条件下，观察到有些噬菌体的噬菌斑直径可以达到5.0mm。用透射电子显微镜观察了三株噬菌体，结果显示它们都属于肌尾噬菌体科(Myoviridae family)中的T4-like噬菌体属。 2.溶源噬菌体P88的分离及基因组分析 采用丝裂霉素C诱导54株溶源菌，利用双层平板法获得了两株溶源噬菌体P88和pro147，且都属于P2-like噬菌体。对噬菌体P88进行全基因组测序，结果显示，P88基因组是双链DNA，一共含有53个可能的ORF，GC含量为52.9％，全长为35814bp，没有tRNA。比对噬菌体P88和pro147的基因组发现，同为P2-like噬菌体的P88和pro147，与噬菌体P2的相似性差别很大（相似性分别为covering5％，ident90％和covering75％，ident97％），并且两株噬菌体本身的基因组相似性非常低(covering6％，ident92％)。然而比较尾丝蛋白氨基酸序列，发现相似度非常高(covering100％，ident70％)，但在C-末端存在两个高变区，分别为576-695位氨基酸(120aa)和716-746位氨基酸(31aa)，推测，尾丝蛋白氨基酸序列中高变区的存在，可能影响了两株噬菌体的宿主谱，这为我们的实验操作提供了一定的理论依据。 3.Tn5转座子筛选与噬菌体受体相关的基因 转座子随机插入突变是基因组分析的重要基因操作工具技术，当转座子插入基因组后，可能会引起插入位点所在基因失活。本实验利用Tn5转座子的这一特性，建立突变库，筛选与禽致病性大肠杆菌T4-like噬菌体受体相关的基因。以携带PUT-Mini-Tn5-Krm质粒的大肠杆菌S17-1(λpir)为供体菌，以萘啶酸诱导的大肠杆菌XM为受体菌，采用双亲结合法，通过双抗平板（氨苄抗性和萘啶酸抗性）筛选接合成功的菌株。采用点滴法，利用T4-like噬菌体QL01进一步筛选，选出3株可能与噬菌体受体相关的突变株，通过Tn5转座子设计反向引物，分析比对相关基因序列，确定其中两株与脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)相关，另一株与肽聚糖(Peptidoglycan，PG)有关。利用无痕缺失同源重组技术，成功构建3株缺失株。用噬菌体QL01点滴不同菌株，野生株XM可以观察到明显的噬菌圈，转座子插入突变株不能观察到噬菌圈，对缺失与受体相关基因的菌株而言，在平板上也可以观察到被噬菌体裂解后留下的模糊的噬菌圈轮廓。通过重复的实验验证，发现，野生株、突变株和缺失株在平板上能够稳定地表现出这样的裂解现象。

目录

声明

摘要

绪论

第一章禽致病性大肠杆菌研究概况及转座子简介

1大肠杆菌的简介

1．1 大肠杆菌的发现与基本形态特征

1．2大肠杆菌的分类

1．3禽致病性大肠杆菌的致病机理与危害

2．1转座子的发现及基本简介

2．2 Tn5转座子的基本结构和转座机制

2．3 Tn5转座子插入位点所在基因的确认

2．4 Tn5转座子插入诱变技术在基因功能研究中的应用前景

第二章噬菌体及噬菌体改造的研究概况

1噬菌体的简介

2噬菌体的形态学特性和基本分类情况

2．1根据噬菌体形态结构分类

2．2根据噬菌体生活特性分类

2．3根据遗传物质分类

3．1噬菌体生活史

3．2噬菌体对细菌致病机理的影响

4．1 溶源性转换(外来基因的表达)

4．2噬菌体的转导作用

5．1噬菌体识别受体机制

5．2噬菌体受体的分类

6噬菌体的应用

6．1作为分子生物学的研究工具

6．2噬菌体治疗

第三章禽源大肠杆菌噬菌体的分离纯化及生物学特性分析

1．1材料

1．2生物学特性研究方法

2结果与分析

2．1噬菌体的分离纯化

2．2噬菌体透射电镜下的形态观察

2．3噬菌体效价的测定

2．4噬菌体pH稳定性的测定

2．5噬菌体热稳定性的测定

2．6噬菌体最佳感染复数(multiplicity of infection，MOI)的测定

2．7噬菌体宿主范围的测定

2．8一步生长曲线的测定

2．9噬菌斑形态以及在不同时间和不同温度下的适应性

3 讨论

参考文献

第四章溶源噬菌体P88的分离及基因组分析

1．1菌株与样品

1．2主要培养基

1．3主要试剂与仪器

1．4温和噬菌体P88的诱导

1．5噬菌体P88的纯化保存

1．6噬菌体P88的电镜观察

1．7提取噬菌体P88和pro147的基因组

1．8基因组测序

1．9噬菌体基因组生物信息学分析

2结果与分析

2．2噬菌体P88透射电镜下的形态观察

2．3噬菌体P88基因组测序及一般特征

2．4假定的ORF功能预测分析

2．5 P2-like噬菌体基因结构注释图分析

2．6比较10株P2-like噬菌体的基本特性和进化关系分析

2．7噬菌体P88和Pro147尾丝蛋白分析

3讨论

参考文献

第五章Tn5转座子筛选与噬菌体受体相关的基因

1材料与方法

1．1菌株、噬菌体以及所用样品

1．2主要培养基

1．3主要试剂与仪器

1．4禽致病性大肠杆菌XM萘啶酸抗性的诱导

1．5双亲结合法

1．6筛选与噬菌体受体相关的理想突变菌株

1．7利用Tn5转座子反向引物测序

1．8筛选被Tn5转座子插入的相关基因

1．9缺失株的构建

2结果与分析

2．1大肠杆菌XM萘啶酸抗性的诱导

2．2双亲本结合法筛选理想突变菌株

2．3筛选被Tn5转座子插入的相关基因

2．4缺失株的构建

3讨论

参考文献

全文总结

致谢

已发表和待发表文章