产耐高温纤维素酶细菌的筛选及酶学性质研究

摘要

纤维素酶的研究对利用具有巨大潜力的可再生资源--纤维素有重要意义.实验筛选出了产耐高温纤维素酶的细菌菌株,获得了有良好耐热性的纤维素酶,并对筛得的菌株的生理生化特性及所产酶的酶学特性进行了研究.实验利用柴草进行高温堆肥,采样后用半限制性培养基筛选,筛选过程中,用3,5-二硝基水杨酸比色法测量所产纤维素酶活,并通过测不含菌体的发酵液酶活,来判断所产是否为胞外酶,结果筛得一株能产胞外耐高温纤维素酶的菌株.通过菌体观察实验、菌体运动性实验、V-P实验、甲基红实验、淀粉水解实验、过氧化氢酶生成测定实验、碳源利用实验等,对筛得的菌株进行分类鉴定,初步判定其属于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus).利用盐析、凝胶过滤层析等方法对纤维素酶进行分离纯化,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检验,电泳结果中出现多条带,而Native-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果只显示一条带,初步判定其为多亚基结构,至少有八个亚基.论文研究了该菌所产纤维素酶的最适温度、pH值、稳定性、酶活影响因子及Km值,确定其最适温度在60℃~70℃之间,最适pH值为7.0.用薄层层析的方法,将酶促反应产物与标准样进行比较,鉴定酶促反应产物,结果显示产物主要为葡萄糖.

目录

文摘

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1引言

1.1降解纤维素的微生物及其酶系

1.2纤维素酶的理化特性

1.2.1纤维素酶的作用机理

1.2.2纤维素酶的多形性

1.2.3分子量、分子结构及等电点

1.2.4纤维素酶最适pH值及酶活的影响因子

1.2.5纤维素酶的诱导性

1.3纤维素酶的发酵生产

1.4纤维素酶的分离纯化

1.5纤维素酶的应用

1.5.1食品工业

1.5.2洗涤剂

1.5.3造纸

L 5.4纺织

1.5.5饲料

1.5.6医药

1.5.7能源工业

1.5.8目前纤维素酶在我国实际运用中的意义及问题

1.6产纤维素酶微生物菌种选育研究进展

1.6.1常规理化诱变

1.6.2基因重组技术

1.6.3基因定位突变技术

1.6.4细胞融合技术

1.7本课题的研究思路和意义

2材料和方法

2.1材料

2.1.1生化试剂

2.1.2其他化学试剂

2.1.3常用储存液及配法

2.1.4培养基配方

2.1.5仪器设备

2.2实验方法

2.2.1筛选培养基的配制方法

2.2.2产纤维素酶菌株的筛选

2.2.3菌株形态的显微观察

2.2.4菌株生理生化特征测定

2.2.5纤维素酶的活力测定

2.2.6蛋白质含量的检测方法

2.2.7纤维素酶的分离纯化

2.2.8聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.2.9反应温度对纤维素酶活力的影响和热稳定性

2.2.10 pH对纤维素酶活力的影响

2.2.11纤维素酶Km测定

2.2.12影响酶活性因子的测定

2.2.13酶促降解纤维素产物鉴定

3结果和分析

3.1菌株筛选结果

3.2菌体形态及运动性观察结果

3.3生理生化特征测定结果及分析

3.4葡萄糖和牛血清白蛋白标准曲线的测定结果

3.5纤维素酶分离纯化

3.6温度和pH值对纤维素酶活性的影响

3.7纤维素酶Km的测定结果

3.8纤维素酶活性的影响因子分析

3.9酶产物薄层层析结果分析

4讨论

4.1产胞外纤维素酶菌的筛选

4.2纤维素酶活性测定

4.3细菌纤维素酶的分离纯化

4.4酶学特性的研究

4.5细菌纤维素酶的SDS-PAGE和Native-PAGE

4.6酶产物的鉴定

4.7本课题获得的细菌纤维素酶的研究前景

结论

致谢

参考文献