重组人源胶原蛋白Ⅲ组织工程支架的制备及性能研究

摘要

胶原蛋白由于其良好的生物学特性已成为组织工程常用的载体材料。本研究所用重组人源胶原蛋白是通过基因工程法设计胶原蛋白基因序列，而后进行翻译所生产的具有人胶原蛋白特征的蛋白质，与从动物体提取的胶原蛋白相比，具有亲水性、无病毒隐患的优点，且易于产业化生产，在组织工程支架材料的研究中有良好的应用前景。但是单一成分作为生物支架时都不能满足支架的要求，本文利用重组人源胶原蛋白Ⅲ与壳聚糖复合，采用戊二醛交联的方法来制备重组人源胶原蛋白Ⅲ/壳聚糖三维海绵支架，并对支架理化性质及细胞相容性进行初步研究。其相关研究结果如下。
　　1.本文首先利用构建的毕赤酵母基因工程菌通过高密度发酵生产重组人源胶原蛋白(RHSC)，采用SDS-PAGE、质谱、氨基酸组分分析及红外光谱等方法对目的蛋白进行分析，发现RHSC是一种胞外分泌型产物，其单体分子量约56kD，二聚体分子量为单体的二倍，一级结构与所设计目的基因相符合，并与SigmaⅢ型胶原蛋白具有相似的结构特征。
　　2.探究重组人源胶原蛋白Ⅲ/壳聚糖支架的制备工艺。将重组人源胶原蛋白Ⅲ和壳聚糖按质量比5∶1，3∶1,1∶1,1∶3，1∶5混合，利用戊二醛进行交联，通过真空冷冻干燥法制备复合多孔支架。考察了支架的形貌特征、孔径大小、孔隙率、吸水率、降解率、热稳定性等理化性质。结果显示，制备的支架孔径在20-50μm，孔隙率都在93％以上，壳聚糖的加入显著改善了支架的降解性能。综合各项理化性能结果，按照1∶1配比制备的支架孔径分布均匀，支架内部孔隙交联度高，吸水率和降解率较为合适，热分解温度达到249.29℃，符合生物材料的基本要求。
　　3.利用不同浓度戊二醛交联制备支架，发现用0.05％的戊二醛进行交联制备的支架呈均匀分布的多孔结构，孔隙丰富，且交联度高，在生理盐水中稳定较好。考虑选用终浓度为0.05％的戊二醛作为交联剂，来制备壳聚糖/重组胶原复合支架。
　　4.将重组人源胶原蛋白Ⅲ和壳聚糖按1∶1的配比，0.05％的戊二醛交联并制备其支架浸提液，通过AO/EB染色，MTT实验，初步探讨了其对人皮肤成纤维细胞的生物相容性。结果发现其支架浸提液细胞毒性小，基本不影响细胞的生长活性，从侧面反映了支架具有良好的细胞相容性，有望应用于皮肤组织工程。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 组织工程概述

1．1．1 组织工程的三个组成部分

1．1．2 组织工程对支架材料的基本要求

1．1．3 组织工程所用材料

1．2 胶原蛋白概述

1．2．1 胶原蛋白定义和分类

1．2．2 胶原蛋白结构特征

1．2．3 胶原蛋白在组织工程中应用

1．3 重组胶原蛋白概述

1．3．1 重组胶原蛋白研究进展

1．3．2 重组人源胶原蛋白的优点

1．4 壳聚糖概述

1．4．1 壳聚糖结构与生物学性质

1．4．2 壳聚糖在组织工程中的应用

1．5 复合材料的发展

1．6 胶原材料常用交联方法

1．6．1 物理交联法

1．6．2 化学交联法

1．7 本论文的研究内容及意义

2 重组人源胶原蛋白Ⅲ的制备及分析鉴定

2．1 实验方法

2．2 重组人源胶原蛋白分析鉴定

2．2．1 SDS-PAGE电泳分析RHSC的分子量

2．2．2 质谱分析

2．2．3 氨基酸序列分析

2．2．4 RHSC的傅里叶红外光谱鉴定

2．3 结果与讨论

2．3．1 SDS-PAGE电泳结果

2．3．2 质谱检测结果及分析

2．3．3 氨基酸组分测定结果

2．3．4 傅里叶变换红外光谱结果分析

2．4 本章小结

3 重组人源胶原蛋白Ⅲ／壳聚糖组织支架制备

3．1 实验材料及仪器设备

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂配制

3．1．3 主要仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 高脱乙酰度壳聚糖的制备

3．2．2 按照5种不同比例配制支架

3．3 多孔支架的性能评价

3．3．1 扫描电镜观察

3．3．2 孔隙率的测定

3．3．3 吸水率／溶胀率测定

3．3．4 体外降解实验

3．3．5 生理盐水浸泡观察支架稳定性

3．3．6 傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)分析

3．3．7 支架热力学性质

3．4 细胞相容性检测

3．4．1 MTT检测细胞的增殖

3．4．2 AO／EB荧光染色检测细胞活力

3．5 结果与讨论

3．5．1 支架外观

3．5．2 显微形貌观察结果

3．5．3 孔隙率测定

3．5．4 吸水率测定

3．5．5 溶胀率测定

3．5．6 体外降解试验结果

3．5．7 生理盐水浸泡结果

3．5．8 傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)分析结果

3．5．9 支架热重结果分析

3．5．10 MTT实验结果

3．5．11 倒置荧光显微镜观察

3．6 本章小结

结论

展望

致谢

参考文献

附录