四溴双酚A厌氧降解菌的筛选及其降解特性研究

摘要

随着四溴双酚A用量的日益增多，四溴双酚A在环境中累积现象也日益明显。因为四溴双酚A具有难降解、生物迁移、生物累积等特点，对环境及生物体存在潜在危害，因此人们对四溴双酚A的关注越来越多，四溴双酚A在环境中的无害化成为研究的一个热点。在四溴双酚A的诸多降解技术中，生物降解技术成本低，效果显著，故被广泛应用。研究以南京城东污水处理厂二沉池污泥为原泥，建立四溴双酚A厌氧降解菌驯化系统，通过驯化、富集培养、分离及纯化筛选出对四溴双酚A降解效果良好的菌株，研究其降解特性，推测其降解途径。
　　构建四溴双酚A厌氧降解菌驯化系统:控制驯化温度为30℃，pH6.8-7.2，机械搅拌速率为200r/min，分批次投加四溴双酚A溶液。稳定驯化100天之后，反应器中微生物对10mg/L的四溴双酚A降解效果明显。经过10天的培养，降解率可达94.8％，因此可将其用于后续四溴双酚A厌氧降解菌的筛选。
　　通过富集培养、分离和纯化，最终分离筛选出两株对四溴双酚A厌氧降解效果良好的菌株，分别命名为NJUST20和NJUST21。在温度30℃，pH7.0，初始四溴双酚A浓度10mg/L条件下培养6天，NJUST20和NJUST21对四溴双酚A的降解率分别为63.5％和42.8％。
　　在30℃条件下培养3天之后，观察两株菌菌落特点得出:NJUST20菌株生长良好，菌落呈规则的圆形，边缘整齐，表面光滑，有光泽，湿润，质地柔软，易挑取，表面凸起，菌落呈黄白色，菌落直径约2-4mm; NJUST21菌落不规整，边缘不明显，湿润，无光泽，质地柔软，表面呈发散的条纹状，菌落颜色为白色，略微有彩虹的光泽。N JUST20和NJUST21革兰氏染色均呈红色，为革兰氏阴性菌。扫描电镜显示:NJUST20细胞呈直杆状，大小约为0.61×(1.33-1.57)μm，周身鞭毛;NJUST21细胞呈接近于球形的短杆状，细胞大小约为0.59×(0.64-0.93)μm，有鞭毛。提取NJUST20和NJUST21的16S rDNA，经PCR扩增、测序及序列分析之后得出:NJUST20属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）肠杆菌属（Enterobacter），命名为Enterobacter sp.NJUST20; NJUST21属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）沙雷氏菌属（Serratia），命名为Serratia sp.NJUST21。对Enterobacter sp.NJUST20的生物化学特性进行检测，并与肠杆菌属中各个种进行对比，发现其符合Enterobacter gergoviae种的各种性质，因此推断Enterobacter sp.NJUST20为Enterobacter gergoviae种中的一株。
　　因NJUST20具有更好的四溴双酚A厌氧降解能力，故以之为目的菌株进行降解特性研究。通过单因素实验得出，NJUST20最佳降解温度为35℃，pH为7.0，在此条件下，初始浓度10mg/L的四溴双酚A，培养6天之后四溴双酚A剩余为1.8mg/L，降解可率达81.9％。对NJUST20厌氧降解四溴双酚A的过程进行动力学研究，发现其符合一级动力学方程，其中降解速率常数k为0.4020d-1，半衰期T1/2为1.6d。
　　通过HPLC和GC-MS对降解产物进行分析，结合相关的文献，推测Enterobacter sp.N JUST20厌氧条件下降解四溴双酚A的降解途径为:四溴双酚A首先脱掉4个溴原子，变成双酚A;之后双酚A两个苯环之间断裂变成2，4-二羟基苯乙酮和2，5-二羟基苯甲酸。2，4-二羟基苯乙酮可能脱掉一个碳原子变成2，4-二羟基苯甲酸;然后2，5-二羟基苯甲酸和2，4-二羟基苯甲酸发生开环反应变成4-羟基-5-甲基-2-己酮;4-羟基-5-甲基-2-己酮最终被降解为无毒且可以被微生物利用的草酸和异丁酸。
　　本课题在受四溴双酚A污染的土壤、污泥、底泥及水体等环境介质的修护工作中具有较大的应用前景，对四溴双酚A厌氧降解工程菌的构建具有重要意义。另外也为四溴双酚A厌氧降解微生物的降解条件及降解途径研究提供了参考。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 溴代阻燃剂概况

1．2 四溴双酚A的主要性质和对环境的影响

1．2．1 四溴双酚A的主要性质

1．2．2 四溴双酚A的分布及其影响

1．3 四溴双酚A的降解研究

1．3．1 四溴双酚A的生物降解技术

1．3．2 四溴双酚A的光降解技术

1．3．3 四溴双酚A的催化氧化降解技术

1．3．4 四溴双酚A的其他降解技术

1．4 课题的主要研究内容

1．4．1 课题来源及研究意义

1．4．2 研究内容

1．4．3 研究的技术路线

2 四溴双酚A厌氧降解茵驯化系统的建立

2．1 材料与方法

2．1．1 试验仪器设备与药品

2．1．2 试验材料来源

2．1．3 四溴双酚A的分析方法

2．1．4 液体培养基的配制

2．2 四溴双酚A厌氧降解菌驯化系统的建立

2．2．1 驯化系统的建立

2．2．2 驯化前后反应器中污泥对四溴双酚A降解效果比较

2．3 本章小结

3 四溴双酚A厌氧降解茵的分离、纯化研究

3．1 材料和方法

3．1．1 菌液的来源

3．1．2 培养基的配制

3．2 四溴双酚A厌氧降解菌的富集培养、分离、纯化和筛选

3．2．1 富集培养

3．2．2 分离和纯化

3．2．3 四溴双酚A厌氧降解菌的筛选

3．3 本章小结

4 四溴双酚A厌氧降解菌的鉴别

4．1 四溴双酚A降解菌的形态学特征

4．1．1 试验用细菌菌液的制备

4．1．2 菌落形态分析

4．1．3 革兰氏染色

4．1．4 扫描电子显微镜观察

4．2 四溴双酚A厌氧降解菌的16S rDNA分析

4．2．1 试验所用基础材料

4．2．2 DNA的提取

4．2．3 PCR扩增

4．2．4 测序

4．2．5 NJUST20和NJUST21的16S rDNA序列分析

4．3 NJUST20的生物化学特性

4．4 本章小结

5 MJUST20的最佳降解条件探究及降解途径分析

5．1 NJUST20的最佳降解条件探究

5．1．1 菌液的制备

5．1．2 温度对NJUST20降解四溴双酚A的影响

5．1．3 pH对NJUST20降解四溴双酚A的影响

5．1．4 NJUST20降解四溴双酚A的动力学研究

5．2 NJUST20厌氧降解四溴双酚A的降解途径分析

5．2．1 高效液相色谱对降解产物的分析

5．2．2 气质联用仪对降解产物的分析

5．2．3 降解途径的分析

5．3 本章小结

6 结论

6．1 主要结论

6．2 课题创新点

6．3 建议

致谢

参考文献

附录

攻读专业硕士学位期间发表的论文及成果

攻读专业硕士学位期间获奖情况

攻读专业硕士学位期间参加的学术交流活动