环境友好型生物医学材料的绿色制备及其应用

摘要

医疗废物危害大、处理难，基于绿色化学“源头削减”的原则，采用生物可降解材料制备医用产品可减少医疗废物产量、降低医疗废物处理难度。生物相容性好、无免疫原性、可生物降解的胶原蛋白是一种重要的生物可降解材料，胶原蛋白三维生物医用海绵可以为细胞粘附、迁移、增殖和分化提供支撑，从而调控细胞功能、诱导新组织形成，在医用领域具有重要应用。
　　本论文通过一种绿色环保无污染的方法制备安全可靠的重组人源胶原蛋白，以此为关键原料，以天然多糖壳聚糖、天然交联剂原花青素(PA)为辅助元素，制备孔径可控的三维多孔生物医用海绵并研究其生物学活性。主要内容包括基因工程菌高密度发酵，分离、纯化，获得环境友好型生物可降解材料重组人源胶原蛋白;优化调控原花青素交联重组人源胶原蛋白-壳聚糖生物医用海绵制备条件，研究其生物医学应用;并通过污水处理和菌渣资源化处理实现胶原蛋白的清洁生产。
　　(1)利用本实验室构建的人源胶原蛋白基因工程菌，在100L发酵罐中进行高密度发酵。通过代谢调控，实现目的蛋白的高效积累，结果如下:菌体平均湿重达449.2±12.2g/L，菌体干重达150.2±2.9g/L，总蛋白浓度达32.17±1.55g/L，重组人源胶原蛋白二聚体(RHC)浓度达16.87±0.70g/L。利用组合分离、纯化技术获取RHC原料。低温高速离心实现固液分离，再通过透析、超滤膜分离纯化方式制备RHC，结果如下:高效液相色谱(HPLC)检测RHC纯度达98.08％，回收率达96.19％;SDS-PAGE电泳标定RHC分子量为112kD、SEM检测RHC纤维直径约为3μm～5μm，紫外-可见分光光谱(UV-vis)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、核磁共振(NMR)分析证明RHC具有Ⅲ型胶原蛋白的特征结构;差示扫描量热法(DSC)分析表明RHC的变性温度为40.68℃。
　　(2)从细胞水平对RHC进行细胞毒性检测。结果如下:水溶性四唑盐(WST-1)检测结果表明细胞在RHC体系中存活率90％左右;吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双荧光染色表明人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞保持完整细胞膜，正常生长并增殖。细胞毒性实验证明RHC是一种生物相容性良好的生物材料。
　　(3)选择原花青素(PA)作为交联剂，采用两种交联模式（浸泡法、预交联法）组装生物医用海绵。
　　①PA浸泡交联法:通过调控RHC和壳聚糖比(1∶4～4∶1)、溶液浓度(1.0％～2.0％，wt％)、相变条件（冷冻速度0.7℃/min～4.1℃/mmin，冷冻终温-20℃～-60℃）等参数制备生物医用海绵;以0.5％(wt％)PA，0.3M、pH值6.81的磷酸盐缓冲溶液(PBS)为交联剂，对不同条件下制备的多组生物医用海绵进行浸泡交联。
　　②PA预交联法:在RHC和壳聚糖比1∶1、溶液浓度1.0％（wt％）、冷冻速率4.1℃/min冷冻干燥条件下，预交联条件为PA浓度0.3％（wt％），PBS中和浓度0.2M、pH值6.24。PA预交联法制备的生物医用海绵:孔径115.01±3.1μm，孔隙率86.4±1.1％，溶胀率39.3±1.8;压缩模量889±2KPa;热失重48.99％（升温至500℃）;胶原酶和溶菌酶混合酶液降解7天后，降解率约为30％，抗酶解率得到有效提高。
　　(4)从细胞水平考察细胞与生物医用海绵的相互作用。利用三维培养技术，通过WST-1检测、AO/EB双荧光染色技术，考察HUVEC细胞在医用海绵中的生存状况。结果如下:孔径较小的生物医用海绵对HUVEC的促增殖能力更强;HUVEC在PA预交联法制备的生物医用海绵中进行三维培养，相比PA浸泡交联海绵培养，细胞粘附更好、增殖更快，并且在生物医用海绵内部迁移。
　　利用HUVEC细胞三维培养技术和实时荧光定量PCR技术对内皮细胞-PA预交联生物医用海绵相互作用相关蛋白基因表达水平变化进行检测。结果表明:HUVEC在生物医用海绵中三维培养，其CD31、VEGF、Integrinβ1、COLⅠ、MMP1等与血管化相关蛋白基因表达水平均比二维培养及壳聚糖生物医用海绵三维培养高，说明PA预交联生物医用海绵能促进内皮细胞增殖及血管化相关基因的表达。
　　(5)高密度发酵和分离、纯化过程中产生的污水处理。
　　通过污水处理、菌渣资源化处理实现无污染生产。对生产过程中产生的污水进行A2O2（厌氧-缺氧-二级好氧）-絮凝沉淀组合工艺处理，并对处理前后的污水根据《酵母工业水污染物排放标准》和《GB21903-2008发酵类制药工业水污染物排放标准》相关指标进行检测和毒理试验。结果表明，处理后的污水达到排放要求，特别是氨氮降至3.76mg/L，总氮含量降至25.5mg/L，总磷含量有效降低至0.222mg/L，脱氮除磷效果明显。毒理Ames试验表明，发酵液和处理后污水均对鼠伤寒沙门氏菌无明显的诱变活性，保证了排入环境的安全性。
　　(6)高密度发酵产生的固废菌渣资源化处理。
　　从发酵废弃物的毕赤酵母菌中提取几丁质-葡聚糖混合多糖(CGC)，以提高菌渣的综合利用，CGC生物相容性好，具有抗氧化、抗菌、抗炎等特性，是一种可应用于化妆品、生物医药等的高附加值产品。通过响应面设计(BBD)优化提取条件为:氢氧化钠浓度0.03M，料液比0.07，温度65℃，响应值为16.3％。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 医疗废物

1．1．1 概述

1．1．2 处理

1．2 生物可降解材料

1．2．1 绿色化学

1．2．2 医疗需求

1．2．3 材料分类

1．2．4 产品制备

1．3 胶原蛋白

1．3．1 概述

1．3．2 传统生产方法

1．3．3 绿色基因工程法

1．4 重组胶原蛋白

1．4．1 重组胶原蛋白生产

1．4．2 重组胶原蛋白应用

1．4．3 清洁后处理

1．5 研究目的和意义

1．6 研究内容

2 环境友好型重组人源胶原蛋白的绿色制备

2．1 材料与方法

2．1．1 实验材料

2．1．2 试剂与仪器

2．1．3 重组人源胶原蛋白高密度发酵

2．1．4 重组人源胶原蛋白分离、纯化

2．1．5 重组人源胶原蛋白表征

2．2 结果与讨论

2．2．1 重组人源胶原蛋白高密度发酵

2．2．2 重组人源胶原蛋白分离、纯化

2．2．3 重组人源胶原蛋白表征

2．3 本章总结

3 三维结构生物医用海绵组装

3．1 材料与方法

3．1．1 试剂与仪器

3．1．2 重组人源胶原蛋白-壳聚糖生物医用海绵组装

3．1．3 原花青素浸泡交联生物医用海绵组装

3．1．4 原花青素预交联生物医用海绵组装

3．1．5 生物医用海绵表征

3．2 结果与讨论

3．2．1 重组人源胶原蛋白．壳聚糖生物医用海绵

3．2．2 原花青素浸泡交联生物医用海绵

3．2．3 原花青素预交联生物医用海绵

3．3 本章总结

4 细胞与生物医用海绵相互作用

4．1 材料与方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 试剂与仪器

4．1．3 细胞毒性检测

4．1．4 细胞三维培养

4．1．5 基因表达

4．2 结果与讨论

4．2．1 重组人源胶原蛋白细胞毒性检测

4．2．2 细胞对生物医用海绵的响应

4．2．3 基因表达

4．3 本章总结

5 污水处理

5．1 材料与方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 试剂与仪器

5．1．3 污水处理

5．1．4 Ames试验

5．2 结果与讨论

5．2．1 污水水质检测

5．2．2 污水处理结果

5．2．3 Ames试验

5．3 本章总结

6 固体废物菌渣综合利用

6．1 材料与方法

6．1．1 试剂与仪器

6．1．2 废菌渣处理

6．2 结果与讨论

6．2．1 废菌渣处理

6．3 本章总结

7 结论与展望

7．1 结论

7．2 创新点

7．3 展望

致谢

参考文献

附录