基于卟啉的仿酶组装及其生物识别分析应用

摘要

高灵敏度、广通用性的生化分析方法对于生物医学、环境科学、食品学等学科的发展至关重要。通常相应的特异性分析方法主要利用生物酶作为分子标记进行信号转换，将生物分子识别反应信号转换为其他更容易检测的物理化学信号。然而，生物酶在稳定性、实用性等方面并不能满足临床和超灵敏分析的要求，因此寻找新的信号转导标记分子是当前研究的重点。其中，借鉴天然酶等的结构，利用生物或纳米材料等仿生组装合成可替代的模拟酶的信号标记是其中最有效的途径。
　　卟啉是过氧化物酶、血红素、细胞色素和叶绿素等生物大分子的核心部分，基于卟啉分子的仿生组装体系在生物传感领域的应用已经有了极其丰富的工作。就其研究方向来说，主要是通过卟啉分子的自身的催化性能，与其他生物或纳米材料通过简单吸附结合克服卟啉单体自身的聚集效应，其组装后的仿生体在结构上与天然酶的结构相差较远，且组装过程和催化机理的研究并不清楚;另一方面，基于卟啉分子的光电性能的仿生组装研究的更是较少涉及。因此，探讨卟啉的催化机理，选择更好仿生组装材料来模拟天然酶结构，合成信号转换效率高和稳定性好仿生组装体十分重要。
　　本论文以卟啉的仿生组装为核心，尝试利用多种材料实现对过氧化物酶结构和催化功能的仿生模拟，改善卟啉单体的催化性能和信号转导能力，结合生物分子识别反应构建特异性的生化检测方法，开展生物化学分析，将包括五部分工作:
　　1、基于过氧化物酶的SPR-DNA传感器的研发
　　辣根过氧化物酶是以铁卟啉为辅基的亚铁血红素的蛋白质，催化过氧化物反应，广泛用于各类生化检测项目。因此，本工作发展了基于天然辣根过氧化物酶催化聚合反应的表面等离子共振(Surface plasmon resonance，简称SPR)基DNA传感检测方法，利用非共价功能化的石墨烯纳米片作为传感基底，并以酶催化诱导的聚合反应作为质量增强剂。该传感器设计方案有多方面目标:首先，通过电化学沉积的方法原位氧还原石墨烯薄膜，并以此优化SPR金膜的基底，由原子力显微拓扑图技术表征该过程，最终使总体的SPR信号响应更加灵敏。其次，以镍离子螯合的胺基三乙酸作为分子支架，苝基衍生物以π-π共轭吸附在石墨烯支撑的SPR金片表面，以镍离子的存在使其支架分子保持一定的组装方向，随后在生物素鳌合在介质表面，捕获探针与生物素相连后可以实现自组装，且维持特定的方向。最后，借鉴夹心免疫分析策略，在目标DNA结合在探针表面后，辣根过氧化物酶标记的报告DNA，实现酶标记单元的结合，实时地将苯胺作为质量增强信号单位剂转化为大分子聚苯胺沉淀，协同实现信号的放大。运用上述配置，得到对特异性DNA精确检测且可重现检测的平台，检测下限达到飞摩尔水平，该部分工作实现了以天然酶为信号标记的沉积反应放大SPR-DNA检测灵敏度。
　　2、基于卟啉与dsDNA仿生组装催化的SPR-DNA传感器
　　该部分设计一种基于“仿生组装的催化沉积”的免标记、超灵敏表面等离子体共振(SPR)核酸分析策略。首先在SPR金片表面以自组装的方式结合肽核酸作为捕获探针，使其可进一步与目标DNA杂交。当捕获探针与目标DNA杂交后，目标DNA末端暴露出的部分核酸序列可以打开颈环结构DNA(H1，H2)引发杂交链聚合反应(HCR)，形成具有一定长度的纳米级DNA双链。基于文献可知卟啉分子可以通过“沟槽嵌入”技术结合到DNA双链双螺旋结构的大沟槽内。带正电荷的对称结构卟啉FeⅢmeso-tetra(N-methyl-4-pyridyl)porphine(FeTMPyP)可适时、动态地与双链DNA结合组装成卟啉-dsDNA结构。由于FeTMPyP作为一种高效的催化剂，DNA双螺旋大沟槽结构可以作为附载体结合大量FeTMPyP形成具有高催化活性，快速催化动力学性质和更高的稳定性的仿生催化剂。该仿生催化剂以4-氯-1-萘酚作为电子供体，催化其还原双氧水，并将4-氯-1-萘酚氧化为不溶性的沉淀物沉积在SPR金片界面，达到典型的SPR信号放大效应。该部分工作实现了对天然酶催化功能的模拟，到达了提高检测灵敏度的效果。
　　3、基于同步生成铜胶束的催化沉淀的SPR-DNA传感器
　　该部分以DNA为模板原位合成铜纳米胶束，并可以吸附催化基于纳米材料的比表面积来实现信号放大。首先，通过优化探针序列选择合适探针序列，同时目标DNA作为桥梁分子可组装在探针DNA层，并开启TdT酶延长DNA链反应，该过程可有SPR实现动态监控并作为第一步放大反应。接着，由于合成的DNA模板链存在，纳米铜胶束可以在DNA骨架上合成，通过铜离子吸附在DNA骨架表面，而后抗坏血酸钠还原形成铜胶束。该过程有电子投射显微镜(TEM)和电化学等技术进行表征，并可以在SPR信号上检测到第二步放大反应。最后，由于存在铜胶束的纳米比表面积，故儿茶酚紫可吸附在其表面并在双氧水催化下形成寡聚物，沉积在SPR金片表面。最后导致电化学信号的增加和SPR信号的第三步放大。通过以上三重放大反应实现对3.21飞摩尔浓度检测，该部分工作展现了多种放大技术和纳米材料在SPR放大方面的应用潜力。
　　4、基于卟啉与类石墨烯纳米片仿生组装的ECL病毒基因检测
　　该部分合成一种有高催化性能和良好延展性的二维石墨烯片实现卟啉分子的仿生组装，以达到和天然酶类似的催化效果，继而设计检测流感病毒基因的电致化学发光传感器。其基本思想是从结构和分子生物学层面，对天然酶结构进行解构与仿生重建。提取过氧化物酶的酶促反应活性中心-卟啉，以廉价均质、具有类石墨烯结构的二维纳米氮化碳单层材料作为载体逼近并还原该辅基的化学环境，耦合简易的取代基修饰、π-π共轭和轴向配位的组装方式，实现在结构上对天然酶的模拟;并进一步以酶促反应涉及的若干动力学参数，如米氏常数（KM）等作为主要技术指标，通过联用多种先进的表征分析手段比较并验证模拟酶在活性上与天然酶相当。以H7N9病毒亚基相互作用的核酸序列作为捕获探针，将该探针组装在量子点电极表面，当有H7N9病毒亚基存在时，捕获探针松散的“颈环”结构打开，刚性的双链结构使其末端生物素暴露，通过生物素与亲和素的反应，将亲和素修饰的模拟酶标记组装到电极表面，消耗共反应剂过氧化氢以衰减量子点的发光实现对DNA的灵敏检测。该部分工作实现了对天然酶结构和功能的双重模拟，提高了模拟酶的稳定性，可作为天然酶的替代物。
　　5、基于卟啉与生物蛋白仿生组装的免疫识别反应ECL传感器
　　受绿色荧光蛋白结构性能的启发，这部分用Zinc proto-porphyrin IX(ZnPPIX)取代天然血红蛋白空穴中的辅基，合成可自身发光的重构ECL生物大分子蛋白，进而用于早期癌症的检测。该重构蛋白在均相体系中合成、发光波长蓝移至远红光区的638 nm、可通过电激发红光ECL信号并简称为重构ECL蛋白（RErP）。重构所用辅基和RErP结构可分别用紫外和圆二色光谱(CD)进行表征。同时，其结构特征中关键的结合常数和结合力等性能参数可用表面等离子体共振(SPR)进行研究。其亲和素修饰过程可用质谱和紫外光谱等技术进行验证。荧光技术重点研究了该重构蛋白的光学性能和ECL性能，最终证明其是一个可通用的和高光学性能的发光体。另一方面，单线态的卟啉可进行多维标记和自我多重光学放大，可摆脱对纳米材料的依赖。同时其光学耐受性的转导技术直接来自于RErP蛋白自身对单线态氧分子的催化作用。因而，基于此设计的检测早期癌症标记物-血管上表皮生长因子(VEGF)检测传感器，其检测下限可低至0.74pg.mL-1并保持高度稳定性和特异性。该部分工作实现了天然酶的改性，简化ECL操作步骤。

目录

声明

摘要

1 绪论

1．1 生物传感器概述

1．2 典型的生物传感分析平台

1．2．1 表面等离子体共振技检测平台

1．2．2 电致化学发光检测平台

1．3 生物传感器的发展现状及其瓶颈问题

1．4 卟啉的仿生组装

1．4．1 卟啉与DNA的仿生组装

1．4．2 卟啉与纳米材料的仿生组装

1．4．3 卟啉与生物蛋白的仿生组装

1．5 本课题提出的意义、研究内容及创新点

1．5．1 课题提出的意义

1．5．2 论文的研究内容和创新点

2 基于天然过氧化物酶的SPR-DNA传感器的研发

2．1 引言

2．2 实验材料和方法

2．2．1 实验试剂

2．2．2 分析测试仪器

2．2．3 电沉积石墨烯纳米片

2．2．4 rGO表面NTA介导的cDNA固定

2．2．5 DNA杂交与酶联寡核苷酸吸附分析

2．2．6 生物催化聚合引发的示踪物质量效应

2．3 实验结果与讨论

2．3．1 rGO薄膜的表征和优化

2．3．2 cDNA／NTPy／rGO的底层构建及其杂交性能

2．3．3 AFM揭示dsDNA／NTPy／rGO的非共价组装

2．3．4 HRP生物标记和催化聚合反应

2．3．5 分析性能和特异性

2．4 小结

3 基于卟啉与dsDNA仿生组装催化的SPR-DNA传感器

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂

3．2．2 实验仪器

3．2．4 tDNA与Au／cDNA组装界面的流式杂交

3．2．5 计算HCR的反应参数

3．2．6 FeTMPyP-dsDNA结构的形成

3．3．1 FeTMPyP．dsDNA结构的光谱表征

3．3．2 HCR反应的表征

3．3．3 仿生催化的免标记氧化还原反应

3．3．4 基于SPR的核酸检测阵列

3．3．5 核酸传感器的选择性和应用

3．4．小结

4 基于同步生成铜胶束的催化沉淀的SPR-DNA传感器

4．1 引言

4．2 实验材料和方法

4．2．1 材料

4．2．2 分析测试仪器

4．2．3 cDNA在芯片表面的自组装

4．2．4 tDNA与Au／cDNA组装界面的流式杂交

4．2．5 动态的TdT延长反应

4．2．6 氧化还原反应沉淀

4．2．7 聚合引发的质量效应

4．3 实验结果与讨论

4．3．1 CuNPs@dsDNA结构的表征

4．3．2 铜胶束的沉积作用

4．3．3 组装探针的优化

4．3．4 组装过程的全表征

4．3．5 分析性能和特异性

4．4 小结

5 基于卟啉与类石墨烯纳米片仿生组装的ECL病毒基因检测

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验试剂

5．2．2 实验仪器

5．2．3 g-C3N4纳米片的制备

5．2．5 链霉亲和素修饰CoⅡ-PPⅨ@g-C3N4探针的制备

5．2．6 CdTe／DMSA QDs的制备

5．2．7 禽流感病毒基因的检测

5．3 结果与讨论

5．3．1 CoⅡ-PPⅨ@g-C3N4模拟酶的化学结构性质

5．3．2 CoⅡ-PPⅨ与g-C3N4的相互作用

5．3．3 动力学参数的测定

5．3．4 CoⅡ-PPⅨ@g-C3N4的电化学动力学

5．3．5 结合模型的理论计算

5．3．6 ECL猝灭机理传感器组装过程表征

5．3．7 核酸传感器组装过程表征

5．3．8 检测条件的优化

5．3．9 病毒基因的检测

5．4 小结

6 基于卟啉与生物蛋白仿生组装的免疫识别反应ECL传感器

6．1 引言

6．2 实验部分

6．2．1 实验试剂

6．2．2 实验仪器

6．2．3 脱附基蛋白(apoHb)的合成

6．2．4 重组蛋白(RErP)的合成

6．2．5 链霉亲和素修饰RErP的合成

6．2．6 VEGF的检测

6．3 实验结果与讨论

6．3．1 RErP结构的表征

6．3．2 ZnPPⅨ与apoHb的结合作用

6．3．3 RErP的光学性能研究

6．3．4 RErP的ECL性能研究

6．3．5 免疫检测组装过程

6．3．6 检测时间优化

6．3．7 免疫检测

6．4 小结

全文总结

致谢

参考文献

附录