诱导型酵母转化重组系统的构建及其应用

摘要

微生物基因组作为次级代谢产物发现的天然资源，在新药开发领域具有很高的研究及应用价值。由于负责合成次级代谢产物的基因簇长达数百至数十万个碱基对，而传统克隆技术难以对其进行有效捕捉，导致仅有一小部分次级代谢产物被发现。TAR克隆技术是利用酿酒酵母体内高效的同源重组机制捕获大片段DNA，但因载体自连和共转化效率低下等问题而限制了其广泛应用。为此，本论文在TAR克隆的基础上构建了诱导型酵母转化重组系统，即iTAR(inducible Transformation-Associated Recombination)克隆系统。该系统是利用半乳糖诱导I-SceI内切酶表达使载体线性化，通过同源重组将目的DNA片段组装至捕捉载体，实现大片段DNA的直接克隆。 本论文采用体外Cas9酶切技术在目的基因簇两端实现特异性切割，使目的DNA末端与iTAR载体上的同源片段严格匹配，以促进“线性-线性”DNA重组。通过将目的DNA片段导入经半乳糖诱导的含捕捉载体的酵母细胞，使iTAR克隆效率至73.2％，显著高于传统的TAR克隆效率(0.5-2％)。经测序分析发现，在假阳性克隆中，70.4％含有突变的I-SceI位点，推测其由非同源末端连接机制(NHEJ)造成。通过敲除宿主NHEJ系统中的关键基因nej1，最终使iTAR克隆效率提高至83.1％，为微生物次级代谢基因簇的大规模克隆奠定了基础。利用iTAR克隆技术从Paenibacillus polymyxa SQR-21S基因组上成功捕捉多粘菌素(polymyxin)基因簇，并将其整合至模式菌株Bacillus subtilis168基因组DNA上。工程菌株不仅表现出polymyxin的抑菌活性，且表达产物的分子量与polymyxin E1一致。 综上所述，本研究构建了一种简单高效的诱导型酵母转化重组系统，利用其将Paenibacillus polymyxa基因组上的polymyxin基因簇转移至Bacillus subtilis168，成功合成了polymyxin。该研究成果为微生物次级代谢的合成生物学和代谢工程提供了新的技术支持和理论依据。

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摘要

图目录

表目录

1绪论

1．1微生物次级代谢

1．1．1聚酮合成酶

1．1．2非核糖体多肽合成酶

1．2次级代谢产物的遗传改造

1．2．1启动子优化

1．2．2转录调控

1．2．3异源表达

1．3基因簇克隆与表达

1．3．1基因组文库策略

1．3．2同源重组策略

1．4本课题的研究目的及意义

2 iTAR系统构建

2．1．2引物

2．1．3生化试剂

2．1．4抗生素

2．1．5仪器与设备

2．1．6培养基

2．1．7常用溶液配制

2．1．8分子生物学操作

2．2结果与讨论

2．2．1重组载体psHTB10的构建

2．2．2重组菌株E．coli BL21-hygR的构建

2．2．3含hygR大片段DNA的制备及其iTAR克隆

2．2．4 iTAR克隆效率的影响因素

2．3本章小结

3 Polymyxin基因簇的克隆

3．1材料与方法

3．1．1菌株与质粒

3．1．2引物

3．1．3生化试剂

3．1．4抗生素

3．1．5仪器与设备

3．1．6培养基

3．1．7常用溶液配制

3．1．8分子生物学操作

3．1．9代谢分析

3．2结果与讨论

3．2．1 Polymyxin基因簇结构分析

3．2．2 Polymyxin基因簇的克隆与表达

3．2．3生物测试与代谢分析

3．3本章小结

4结论与展望

4．1结论

4．2展望

致谢

参考文献

附录