重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及嗜甲醇酵母(Pichia pastoris)的转化

摘要

目的:为用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原,构建在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG-pPIC9K, 转化嗜甲醇酵母. 方法:根据βhCG的cDNA 序列设计两条引物,使上游带EcoR I酶切位点,下游带Not I酶切位点,以质粒βhCG-PBS KS为模板,进行PCR扩增反应;将所得的DNA片段经EcoR I和Not I双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接,然后导入大肠杆菌DH5α,用PCR筛选阳性克隆并用双酶切鉴定重组子βhCG-pPIC9K. 再用电打孔法转化酵母(Pichia pastoris),用缺组氨酸MD平板筛选阳性株并在含G418的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株. 结果:用所设计的引物扩增出两端分别带EcoR I 和Not I酶切位点的βhCG DNA片段,插入pPIC9K并导入DH5α获得阳性克隆,经PCR 反应和双酶切鉴定表明重组质粒是βhCG-pPIC9K,并转化嗜甲醇酵母获得耐受4 mg/mL G418的菌株. 结论:构建了重组质粒βhCG-pPIC9K并获得插入重组质粒βhCG-pPIC9K的嗜甲醇酵母.