生物降解与植物细胞壁结构的AFM单分子识别研究

摘要

在大规模生物质的生化转化过程中,主要挑战包括:纤维素酶的昂贵价格以及植物细胞壁复杂结构中多糖成分的酶解效率.这些挑战使越来越多的人对酶解的主导模式研究产生了浓烈兴趣.在单分子层面上研究生物能源的转化机理尤其重要.修饰分子的原子力显微镜(AFM)探针与样品特定成分之间的相互作用会引起探针在轻敲扫描过程中的共振振幅减小,信号处理之后会产生相应的识别图像.结合AFM高分辨形貌图像和特异性识别图像对生物分子进行分析的技术被命名为PicoTREC技术.PicoTREC是一种很重要的新型生物化学探测技术,该技术可以将AFM探针上配体相互作用的特定分子从复杂的样品结构中区别出来,同时可以对分子的特定动态过程进行实时观察.在本论文中,结合一系列随时间变化的AFM形貌、振幅和识别图像,在单分子层面上实时观察生物质样本的原位酶解过程.另外,利用该识别技术观察原生质体细胞膜表面的类细胞壁结构的再生过程,特异性识别不同成分多糖和糖蛋白的生成状况,为进一步了解植物细胞壁的成分和结构奠定了良好实验基础.本论文研究成果如下: 1)研究了糖结合模块分子(CBM3a)在晶体纤维素表面的单分子动力学过程,并利用AFM单分子动态力学谱(SMDFS)测量了该分子与纤维素之间的相互作用力;证实了CBM3a与晶体纤维素之间具有特异性相互作用,其解离力大小为44.96±18.80pN,以及绑定纤维素最经济的CBM3a浓度值5.1×10-7M.对CBM-纤维素相互作用的单分子识别研究有利于对生物质-酶单分子相互作用的深入探索. 2)将CBM3a修饰于AFM探针,从而利用CBM3a与晶体纤维素之间存在的特异性相互作用获得晶体纤维素的有效识别信号.通过AFM扫描自然细胞壁以及转基因细胞壁样品,进行对比分析其结构成分的不同.并在植物细胞壁酶解实验中,分析一系列随时间变化的AFM图像,得到不同酶水解细胞壁过程的单分子细节.纤维素内切酶(EG)会有效移除自然样品中的非晶体纤维素,使晶体纤维更完整地暴露出来,从而有利于晶体纤维素的进一步水解.纤维素外切酶(CBHI)水解自然细胞壁样品的过程与样品表面结构的接触面积有关.然而由于自然细胞壁复杂结构,所以很难从中提取纤维素水解信息的细节. 3)实时观察并定量检测预处理提取的纤维素被不同成分酶溶液完全水解的过程,不同种类水解酶之间的协同作用会显著加速纤维素水解.在对提取纤维素水解过程中,含有纤维素外切酶(CBHI)和β-葡糖苷酶(β-G)的酶溶液,与全酶溶液(主要成分为纤维素内切酶和纤维素外切酶)相似的水解能力.利用功能化的AFM形貌图像和识别图像对提取的单个纤维素进行了全面的实时水解动态分析.根据纤维素基底表面的裂隙,将单个晶体纤维素分成几段不同的区域.在水解过程中,同时观察到两种不同的水解模式:有序的纤维素解聚和拥堵酶分子引起的纤维素剥落.重点观察和分析纤维素微纤维的剥落过程,总结出造成该现象的主要影响因素.一个区域的纤维素被剥落后,新的裂缝会产生,从而使酶分子再次被固定.纤维剥落现象与纤维素纤维宽度有很大关系.对剥落纤维酶解过程中产生的纤维高度进行统计测量,剥离的纤维高度范围为11~24nm.当纤维高度超过11nm的时候,酶分子不再对纤维素微纤维进行有序解聚,而是会形成酶分子的拥堵从而使得纤维素纤维剥落. 4)用植物细胞壁中不同多糖和糖蛋白的多种单克隆抗体修饰AFM探针(阿拉伯半乳糖蛋白的单克隆抗体为JIM14,JIM13和LM2;果胶的单克隆抗体为LM5和LM13),并继续利用CBM3a分子修饰AFM探针对晶体纤维素进行识别扫描.实时观察在植物细胞壁再生过程中不同多糖和糖蛋白的生成和分布状况.在没有细胞壁结构的原生质体细胞膜上未发现纤维素的识别信号,但是观察到了阿拉伯半乳糖蛋白(AGP)和果胶的识别信号.在植物细胞壁再生过程中,根据相应的AFM图像,计算得到不同时间点样品表面粗糙度和识别面积百分比,从而量化不同成分的生成信息.通过扫描观察被磷脂酶C(PLC)处理的原生质体,发现原生质体表面的果胶和AGP相辅相成存在.最后,观察不同成分识别信号在细胞壁再生过程中的变化,并总结出不同成分在细胞壁再生过程中出现的大致顺序:首先生成果胶,其次是AGP,最后为纤维素.

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