γ-谷氨酰转肽酶的制备、酶学性质及其在小肽合成中应用的研究

摘要

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,γ-GTP)可以催化γ-谷氨酰基化合物中谷氨酰基的水解并把它转移到其他氨基酸或小肽上,具有非常广阔的工业应用前景.国外已经对γ-GTP的性质及其在小肽合成中的应用做了深入的研究.但国内对其研究还几乎是空白.本论文从本实验室保藏的γ-GTP高产菌-枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NX-2出发,通过对培养基和培养条件的优化,确定了适合实验室摇瓶培养和发酵罐培养的培养基:蔗糖2﹪,玉米浆3﹪,蛋白胨1﹪,K<,2>HPO<,4> 1.5﹪,MgSO<,4>0.05﹪;培养条件(摇瓶中):起始pH7.5,装液量60mL/500mL三角瓶,培养温度32℃,培养时间36小时.摇瓶中B.subtilis NX-2产γ-GTP的量由2.0U/mL提高到3.2U/mL,大于文献报道的最高3.0U/mL.并研究了γ-GTP在摇瓶和发酵罐中生长的过程曲线.研究了γ-GTP在(Bacillus subtilis)NX-2发酵体系中的分布:γ-GTP产生于B.subtilis NX-2胞周间质处,60﹪分泌到发酵液中.建立了针对该发酵体系的γ-GTP纯化方法:首先用等体积丙酮沉降,复溶后用60-90﹪硫酸铵梯度分离,然后以pH8.0,0.05mol/L Tris-HCL为缓冲液,进行疏水层析分离,以0.3mol/L硫酸铵洗脱,最后进行DEAE离子交换层析,以0.1mol/L-0.4mol/LNaCL(30min)梯度洗脱,收集第一个洗脱峰.对纯化得到的酶蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶色谱分析,该酶两个亚基分别为43,000Da和32,000Da.γ-GTP可以耐受60℃以下的温度,在碱性环境下比较稳定,酸性环境下很容易失活.最适反应温度为40℃,最适反应pH值为8.0.在较低温度下表现出较高的接肽率,在40℃接肽活力最高,60℃时水解活力最高.γ-GTP的接肽率随着pH的升高而升高,在pH8.0时水解活力和接肽活力均为最高.随着时间的变化,γ-GTP的接肽率逐渐下降而水解率逐渐上升.初步确定γ-GTP的催化水解和转肽反应是由两条亚基协同完成,而并不是每条亚基均独立具有全部的活性.酶的催化转化机制为乒乓机制.通过薄层色谱-质谱联用等手段证明了γ-GTP可以完成γ-谷氨酰基在氨基酸和小肽之间的转接,可以应用与谷胱甘肽前体的合成.

目录

文摘

英文文摘

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第一章序论

1.1立题依据与意义

1.2 γ-谷氨酰转肽酶的研究现状

1.3谷胱甘肽的研究现状

1.4本课题研究思路和内容

第二章B.subtilis NX-2培养条件的优化

2.1材料与方法

2.2结果与讨论

2.2.1 K2HPO4对B.subtilis NX-2产γ-GTP的影响

2.2.2 MgSO4对B.subtilis NX-2产γ-GTP的影响

2.2.3碳源对subtilis NX-2产γ-GTP的影响

2.2.4单一氮源对subtilis NX-2产γ-GTP的影响

2.2.5混合氮源对subtilis NX-2产γ-GTP的影响

2.2.6以蔗糖为碳源培养基成分的正交实验

2.2.7初始pH对B.subtilis NX-2产γ-GTP的影响

2.2.8摇瓶装液量对B.subtilis NX-2产γ-GTP的影响

2.2.9 NX-2菌的摇瓶培养生产γ-C-TP的过程曲线

2.2.10 NX-2菌的发酵罐中生产γ-GTP的过程曲线

2.3主要结论

第三章γ-GTP的分离与纯化

3.1材料与方法

3.2结果与讨论

3.2.1酶在发酵体系中的分布

3.2.2酶在细胞内的分布

3.2.3丙酮浓度的选择

3.2.4硫酸铵浓度的选择

3.2.5疏水层析

3.2.6 DEAE弱阴离子交换层析

3.2.7各步纯化效果

3.2.8 SDS聚丙酰胺凝胶电泳

3.3主要结论

第四章γ-GTP的酶学性质及催化机理的研究

4.1材料与方法

4.2结果与讨论

4.2.1对温度的耐受性

4.2.2酶对pH的耐受性

4.2.3酶的最适温度

4.2.4酶的最适反应pH值

4.2.5金属离子对酶活力的影响

4.2.6反应温度对酶催化水解和转肽能力的影响

4.2.7反应pH对酶催化水解和转肽能力的影响

4.2.8反应时间对酶催化水解和转肽能力的影响

4.2.9温度对γ-GTP水解和自转肽的影响

4.2.11反应时间对酶催化水解和自转肽能力的影响

4.3主要结论

第五章γ-GTP在小肽合成中的应用

5.1材料与方法

5.2结果与讨论

5.2.1 γ-谷氨酰对硝基苯胺与双甘氨肽反应体分析

5.2.2 L-谷氨酰胺与双甘氨肽反应体分析

5.2.3多种氨基酸为受体转肽情况

5.2.4在谷胱甘肽合成中的应用

5.3主要结论

第六章结论与展望

6.1结论

6.2今后工作的展望

参考文献

附录Ⅰ

附录Ⅱ

附录Ⅲ

附录Ⅳ

致谢

硕士论文期间所获成果