新型低温碱性蛋白酶的纯化和性质研究

摘要

蛋白酶是三大工业用酶之一，产值约占国际酶市场的60％。由于其在洗涤，皮革，丝绸，医药、食品、废物处理、小肽合成等各个行业表现出的广阔应用前景及巨大商业价值，蛋白酶一直是国内外研究的热点。
　　 本研究从土壤中筛选到一株低温碱性蛋白酶生产菌，其生理生化性质与Pseudomonas mosselii相近，经16s rDNA鉴定与Pseudomonas mosselii相似性高达99％，将其命名为Pseudomonas mosselii XG1。
　　 研究发现P.mosselii XG1蛋白酶在低温下稳定性良好，并在常温或低温下能有效降解发酵液中的杂蛋白。利用此性质将Pseudomonas mosselii XG1发酵液在4℃下放置72h后经硫酸铵分级沉淀一步纯化得到电泳纯的蛋白酶，其亚基分子量为45KDa。比活力为2499.5U/mg，纯化倍数为3.56，纯化回收率达到50.7％。
　　 P.mosselii XG1蛋白酶最适pH为9.0，在很宽的pH范围(pH5.0-12.0)内保持高活力；44℃时活性最高，热稳定性较差，Ca2+能显著改善酶的热稳定性。Mn2+对酶活有显著促进作用，Fe2+则有微弱抑制作用。金属蛋白酶抑制剂1，10-菲咯啉对酶活有抑制，表明活性中心附近可能有Zn2+离子。丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)对酶活力没有影响，表明该酶可能不属于丝氨酸蛋白酶家族。5mmol/L的二硫苏糖醇抑制了50％的酶活，说明二硫键可能是稳定该蛋白酶三级结构所必需。以酪蛋白酸水解物为底物测得P.mosselii XG1蛋白酶的米氏常数Km为0.607mg/ml，最大反应速率υmax为763.359U/ml。
　　 XG1蛋白酶的底物选择性研究表明该蛋白酶不易水解各种氨基酸对硝基苯胺的衍生物(常用人工底物)，较易剪切长链的肽链。以氧化型牛胰岛素B链为底物检测P.mosselii XG1蛋白酶的切割特异性，反应3min时，蛋白酶的优先切割位点为Ala14-Leu15，Leu15-Tyr16，Tyr16-Leu17；反应60min后，蛋白酶的酶切位点为Asn3-Gln4，Gln4-His5，Cys7-Gly8，Glu13-Ala14，Ala14-Leu15，Leu15-Tyr16，Tyr16-Leu17，Tyr26-Thr27。
　　 P.mosselii XG1蛋白酶对鳌合剂EDTA、氧化剂暨漂白剂H2O2和表面活性剂SDS耐受性良好。与各种商业洗涤剂放置30min后测定酶活，奥妙()洗衣粉对酶活力影响最大，处理后残余酶活为84.9％，其他洗涤剂对酶活力基本没有影响。
　　 本研究筛选所得P.mosselii XG1蛋白酶具有耐高碱性、耐表面活性剂、螯合剂、氧化剂和漂白剂等性能。与常用商业洗涤剂添加蛋白酶Savinase，Alcalase相比，P.mosselii XG1蛋白酶最适反应温度低，在低温也下具有较高的酶活。因此P.mosselii XG1所产低温碱性蛋白酶具有重要的理论研究与应用开发价值。