内生真菌与盾叶薯蓣细胞共生培养合成薯蓣皂苷元研究

摘要

盾叶薯蓣(DioscoreazingiberensisC.H.Wright)是我国特有的、具有重要经济意义的药用植物，其有效成分薯蓣皂苷元(Diosgenin)是合成甾体激素和甾体避孕药物药物的重要原料。随着甾体药物消费量增大，薯蓣皂甙元的需求量也越来越大，解决薯蓣皂苷元的资源问题成为国内外关注的热点。通过植物组织和细胞培养生产次生代谢产物是解决这一问题的较好方法，但仍存在产率低等问题。植物内生真菌是植物微生态系统中的天然组成成分，在与宿主植物长期共同生活过程中二者建立了互惠共生关系，内生真菌对宿主植物的作用主要表现在促进宿主植物的生长发育，增强宿主植物的抗逆性和促进宿主体内次生代谢物的形成和积累等方面。
　　 基于植物内生真菌在长期进化过程中与宿主建立的互惠共生的关系及其对宿主植物的作用，本研究以盾叶薯蓣为研究材料，从盾叶薯蓣根状茎中分离得到一株在离体条件下能与盾叶薯蓣细胞协调生长的内生真菌RE0105，首次将其引入到植物细胞培养体系，在离体条件下建立内生真菌RE0105与盾叶薯蓣细胞协调生长的共生培养体系，研究内生真菌对共生培养细胞生长、对营养物质的要求和利用以及对次生代谢产物合成的影响；同时从内生真菌RE0105侵染对盾叶薯蓣细胞酶促防御反应变化、对次生代谢相关酶活性变化影响以及内生真菌调节盾叶薯蓣细胞次生代谢物薯蓣皂苷元合成等角度研究并探讨了内生真菌RE0105对盾叶薯蓣细胞生长和薯蓣皂苷元合成影响以及内生真菌与宿主细胞形成互惠共生关系的机理。获得的研究成果如下：
　　 1.首次从盾叶薯蓣根状茎中分离获得一株能与离体培养的盾叶薯蓣细胞协调生长的内生真菌RE0105。对该内生真菌生物学和化学特性研究发现内生真菌RE0105生长缓慢，只形成基内菌丝和气生菌丝，不能产生孢子；富含有机营养的培养基有利于RE0105生长，并且盾叶薯蓣细胞提取物和适宜浓度生长素(20μmol/LNAA和20μmol/L2，4-D)可显著促进其生长；首次发现内生真菌RE0105能产生与宿主植物相同的次生代谢产物薯蓣皂苷元。此外，对内生真菌RE0105ITS1-5.8S-ITS2区域的碱基序列进行了测定并选择Libertellasp.等19株参考菌株进行了系统发育分析，发现内生真菌RE0105与Libertellasp.具有较近亲缘关系，二者碱基相似性为76.1％。
　　 2.首次建立了离体条件下内生真菌RE0105与盾叶薯蓣悬浮细胞协调生长的共生培养体系。建立共生培养体系的条件为以植物细胞培养基MS培养基为共生培养基，选用胞龄为10～14d细胞团颗粒小的盾叶薯蓣悬浮细胞(平均粒径<0.5mm)为种源、细胞接种量为1/5～1.5/5，在细胞培养任何时间接入适量的内生真菌均可建立内生真菌与盾叶薯蓣细胞协调长的共生培养体系。同时利用电镜技术研究了内生真菌与离体培养的盾叶薯蓣细胞共生行为，发现内生真菌RE0105既可生长于盾叶薯蓣细胞外，也能侵入盾叶薯蓣细胞内，并且真菌的侵入没有引起细胞裂解死亡，离体条件下二者间为内/外共生关系。
　　 3.首次研究了共生培养体系中内生真菌RE0105对盾叶薯蓣细胞的营养要求和营养物质消耗利用的影响。内生真菌RE0105侵染并不改变盾叶薯蓣悬浮细胞对蔗糖、硫酸镁和氯化钙需求水平，细胞生长的最适的蔗糖、硫酸镁和氯化钙初始浓度分别为30g/L、370mg/L和660mg/L；但内生真菌RE0105提高盾叶薯蓣悬浮细胞对硝酸铵和磷酸盐需求水平和降低对硝酸钾需求水平，单独培养细胞生长最适硝酸铵、磷酸盐和硝酸钾初始浓度分别为1650mg/L、1.25mmol/L，和2850mg/L，而与内生真菌RE0105共生培养细胞生长所需的适宜硝酸铵、磷酸盐和硝酸钾浓度分别为3330mg/L、1.88mmol/L和1900mg/L。内生真菌RE0105提高共生培养细胞对糖、氨态氮的消耗利用速度，降低对磷营养的吸收利用速率，但内生真菌提高了共培养细胞最终对磷的吸收利用能力。
　　 4.首次研究了共生培养体系中内生真菌RE0105对盾叶悬浮薯蓣细胞生长和薯蓣皂苷元合成的影响。内生真菌RE0105对盾叶薯蓣悬浮细胞生长具有促进作用，主要表现在内生真菌侵染可提高盾叶薯蓣悬浮培养细胞的生长速率和生物量积累特别是干物质生物量的积累。内生真菌RE0105对盾叶薯蓣细胞薯蓣皂苷元合成能力的影响与内生真菌接种时间有关，在悬浮细胞培养1d时接种内生真菌时，共生培养细胞薯蓣皂苷元的含量和产量最高，分别比单独培养细胞提高了35.11％和41.86％。
　　 5.研究了内生真菌RE0105侵染对盾叶薯蓣细胞酶促防御反应变化的影响以及盾叶薯蓣细胞培养过程中酸性磷酸酶活性变化及其与薯蓣皂元合成关系。RE0105侵染并未触发盾叶薯蓣细胞抗氧化酶系统参与防御反应，但诱发了宿主细胞多酚氧化酶、几丁质酶、苯丙氨酸解氨酶参与的防御反应。抗氧化酶防御系统在一定程度上的钝化可能是内生真菌与盾叶薯蓣细胞建立协调生长关系的基础，多酚氧化酶、几丁质酶和苯丙氨酸解氨酶的激活可能是内生真菌提高宿主细胞提高次生代谢产物薯蓣皂苷元合成能力的基础。研究还发现RE0105侵染影响盾叶薯蓣细胞过氧化物酶同工酶和多酚氧化酶同工酶表达。与RE0105共生培养细胞除了表达二者原有的同工酶谱带外，还有新的同工酶谱带表达。内生真菌侵染提高了培养细胞酸性磷酸酶活性，从而提高细胞合成薯蓣皂苷元能力，同时发现细胞培养过程中酸性磷酸酶活性动态变化规律基本能够反映出薯蓣皂苷元合成的变化规律，可以将细胞培养过程中酸性磷酸酶活性变化作为甙元合成能力变化的指标。
　　 6.利用HPLC-MS技术分析比较了盾叶薯蓣细胞及与内生真菌共生培养细胞合成的代谢产物组成变化。在内生真菌与盾叶薯蓣细胞的相互作用中，内生真菌能够快速地诱导细胞中与薯蓣皂苷元合成相关的特定基因的表达，活化薯蓣皂苷元合成代谢途径，提高薯蓣皂苷元的合成。内生真菌RE0105对盾叶薯蓣细胞的次生代谢具有调节作用。