重组慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ体外表达的研究

摘要

目的：构建人巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的B区缺失的人凝血因子Ⅷ(BDDhFⅧ)基因的重组慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ，观察FⅧ活性在不同靶细胞293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver、MSC中的表达。 方法：采用基因重组技术，用限制性内切酶Xhol I从质粒pDLZ6中将目的基因BDDhFⅧ片段切出，克隆至pXZ208的Xhol I位点，构建转移质粒pXZ208-BDDhFHU，限制性酶切法鉴定载体的连接方向。采用改良磷酸钙共沉淀法将重组质粒pXZ208-BDDhFⅧ与包装质粒△ NRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞，包装后的病毒颗粒感染293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver和MSC细胞。感染48h后逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDDhFⅧ基因的转录、一期法检测细胞培养上清FⅧ的活性、流式细胞术(FCM)检测病毒的感染效率。感染后的靶细胞传代培养，PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。 结果：成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ，包装后，重组慢病毒能感染293T、HLF、NIH3T3、MSC、mBMEC和Chang-Liver细胞，其基因转导效率有差异，分别为(59.57±5.24)％、(74.52±7.57)％、(41.33±5.82)％、(42.34±5.84)％、(14.38±2.73)％和(27.24±6.53)％。RT-PCR法能够检测到BDDhFⅧ基因的转录。 感染48h后即可检测到293T、HLF、NIH3T3、mBMEC、Chang-Liver和MSC细胞上清中FⅧ的表达， FⅧ活性有差异，分别为(43.2±3.2)％、(54.1±5.6)％、(14.2±2.8)％、(8.7±1.3)％、(22.5±2.9)％和(12.5±2.7)％。感染后的传代细胞中有BDDhFⅧ基因的整合。 结论： 1.成功构建了CMV启动子驱动的人凝血因子Ⅷ的慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ； 2.采用改良的磷酸钙沉淀法共转染三质粒，制备高滴度的病毒，在未经超速离心的情况下，病毒滴度达到了10<'6>数量级，能够满足体内实验的需要； 3.重组慢病毒能够高效感染多种离体培养的细胞并表达有活性的FⅧ； 4.慢病毒介导的外源基因能够整合到靶细胞的基因组中，为目的基因的长期表达奠定了基础。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分携带B区缺失的人凝血因子Ⅷ慢病毒表达载体的构建和鉴定

材料与方法

1材料

2方法

结果

第二部分重组慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅷ在体外培养细胞中的表达

材料与方法

1材料

2方法

3统计学分析

结果

讨论

结论

论文图表

参考文献

综述 血友病A基因治疗中病毒载体的研究进展

攻读硕士学位期间发表学术论文题目

致谢