重组慢病毒载体介导的人B区缺失凝血因子Ⅷ在NOD/SCID小鼠体内表达的研究

摘要

目的: 包装人巨细胞病毒立早启动子(CMV)驱动的B区缺失的人凝血因子Ⅷ(BDDhFⅧ)基因的重组慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ，观察其在293T细胞和NOD/SCID小鼠体内的表达。 方法: 采用阳离子脂质体法将重组质粒pXZ208-BDDhFⅧ、pXZ171与包装质粒△NRF、包膜蛋白质粒pVSVG共转染293T包装细胞，包装后的病毒颗粒体外感染293T细胞。感染72h后逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDD-hFⅧ基因的转录、一期法检测细胞培养上清FⅧ促凝活性(FⅧ：C)、ELISA法检测细胞培养上清中FⅧ抗原(FⅧ：Ag)、流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率。感染后的靶细胞传代培养，PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。超速离心法浓缩病毒颗粒，经门静脉注射途径感染NOD/SCID小鼠。感染后72h、一周和一月后测定小鼠血浆中FⅧ：Ag。RT-PCR法检测小鼠肝脏中BDD-hFⅧ基因的转录。 结果: 重组病毒体外感染293T细胞，其基因转导效率达90％。携带BDDhFⅧ基因的慢病毒颗粒感染293T细胞后72h培养上清中FⅧ：C水平为正常水平的(27.4±5.7)％，hFⅧ：Ag水平为(483±26)mU/ml；RT-PCR法检测到BDDhFⅧ基因的转录。对照组未检测到hFⅧ表达及活性。感染后的传代细胞中有BDDhFⅧ基因的整合。重组病毒颗粒经门静脉感染NOD/SCID小鼠，感染后72h、一周和一月后hFⅧ：Ag分别为(49±6)mU/ml，(54±8)mU/ml和(23±4)mU/ml。感染后一月使用RT-PCR检测到小鼠肝脏中有BDD-hFⅧ转录。 结论: 携带BDD-hFⅧ的慢病毒颗粒在体外可以高效感染293T细胞并表达具有生物活性的hFⅧ。该病毒颗粒经门静脉感染NOD/SCID小鼠后可获得稳定的hFⅧ表达。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前言

第一部分 携带B区缺失的人凝血因子Ⅷ慢病毒的大量包装与浓缩

材料与方法

1材料

2方法

结果

第二部分 慢病毒介导B区缺失的人凝血因子Ⅷ的体外表达

材料与方法

1材料

2.方法

结果

第三部分 慢病毒介导B区缺失的人凝血因子FⅧ在NOD/SCID小鼠中表达

材料与方法

1材料

2.方法

结果

讨论

结论

论文图片

参考文献

综述 血友病A基因治疗进展

攻读硕士学位期间发表学术论文题目

致谢