替莫唑胺联合HSV1-tk/GCV系统治疗脑胶质瘤的体外实验性研究

摘要

目的:探讨替莫唑胺(temozolomide，TMZ)单独以及联合HSV1-tk/GCV系统对体外培养的人胶质瘤细胞系U251细胞的体外杀伤作用及可能作用机理。 方法: 1.TMZ部分：实验分为对照组及实验组，实验组分别以6种不同浓度的TMZ(10μM、25μM、50μM、100μM、200μM、400μM)作用于U251细胞，分别于24h、48h、72h时倒置显微镜观察细胞形态学的改变；MTT比色法检测细胞活力；流式细胞仪检测细胞周期分布和凋亡率。 2.TMZ联合HSV1-tk/GCV系统部分：用携带tk基因的重组逆转录病毒转染U251细胞并筛选、鉴定。转染与未转染tk基因的U251细胞按1：9混合进行实验。实验分为对照组、GCV组、GCV+TMZ组及TMZ组。GCV组以5种浓度GCV(0.2μM、0.5μM、1.0μM、2.0μM、4.0μM)作用于混合细胞；GCV+TMZ组在GCV组的基础上各加入50μM TMZ；TMZ组只加入50μM TMZ。培养72h后，光学显微镜下观察细胞形态学改变；MTT比色法检测各组细胞活力；流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡率。 结果: 1.TMZ部分：(1)倒置显微镜下观察TMZ对U251细胞的杀伤作用随作用时间及TMZ浓度增加而增加。(2)MTT比色法检测显示：≥50μM的TMZ对U251细胞的抑制率明显增高(P<0.01)，并与作用时间正相关。各浓度TMZ对U251细胞的72h抑制率(％)随浓度增加而增加，依次为0.41±1.23、7.43±9.29、31.59±3.74、64.53±3.12、82.18±2.80、86.15±1.34；72h TMZ的半数抑制浓度(IC50)为81μM(15.73μg/ml)。(3)流式细胞术检测显示，50μM及100μM TMZ处理后，与对照组相比，U251细胞的细胞周期分布主要表现为G<,2>-M期的比例明显增加(P<0.01)；细胞凋亡率增加不明显。 2.TMZ联合HSV1-tk/GCV系统部分：(1)倒置显微镜下观察相同条件下GCV+TMZ组存活的细胞较GCV组减少。(2)GCV组(GCV≥0.5μM)细胞的存活率明显低于对照组(P<0.01)。相同浓度GCV条件下，GCV+TMZ组的存活率明显低于GCV组(P<0.01)。GCV+TMZ组的细胞生存曲线较GCV组明显左移，72h GCV的IC50，GCV组(1.73μM)是GCV+TMZ组(0.81μM)的2.35倍。50μM TMZ对U251/TK混合细胞的抑制率为30.05±2.67％，与其对单纯U251细胞的抑制率(％)相仿(31.59±3.74)。GCV+TMZ组(GCV≥1.0μM)与TMZ组抑制率比较存在差异(P<0.01)。(3)流式细胞术检测显示，GCV组与对照组相比，细胞周期出现S期及G<,2>-M期的比例增加(P<0.01)；细胞凋亡率增加(P<0.01)。GCV+TMZ组与GCV组相比，G<,0-1>期明显减少(P<0.01)、G<,2>-M期进一步增加(P<0.01)，细胞凋亡率也进一步增加(P<0.01)。 结论: 1.TMZ具有抑制人胶质瘤细胞系U251细胞生长的作用，抑制作用呈时间和剂量依赖性。 2.TMZ可能是通过改变细胞周期的分布而非诱导凋亡来杀伤U251细胞。 3.TMZ可以增强HSV1-tk/GCV系统的旁观者效应， 4.TMZ可能是通过改变细胞周期的分布以及促进凋亡来增加HSV1-tk/GCV系统的旁观者效应。

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材料和方法

1.材料

2.方法

结果

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结论

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胶质瘤细胞的培养及其应用综述

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