FoxO3a在三氧化二砷诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡中作用的实验研究

摘要

目的: 研究三氧化二砷(As2O3)对体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞系诱导其凋亡的生物学效应，探讨FoxO3a在As2O3作用于MCF-7细胞系后的表达及诱导细胞凋亡的可能机制，为As2O3抗实体瘤的临床应用提供理论和实验依据。
　　 方法:
　　 1.细胞培养：将人乳腺癌细胞株MCF-7常规接种于含体积分数为10％灭活胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的新鲜RPMI 1640培养液中，置 37℃、饱和湿度和5％CO2培养箱中，定期观察细胞生长情况 ,待细胞融合率达到 80％以上时用0.25％胰酶消化液消化并1∶2传代培养至实验所需细胞数；
　　 2.实验分组：根据不同检测指标分为阴性对照组和As2O3不同浓度干预组（2.0μmol/L、4.0μmol/L、8.0μmol/L；As2O3作用不同时间组（0h、6h、12h、24h、48h）；As2O3与MCF-7细胞培养后再加IKKβ激动剂（TNF-α10ng/mL）处理组；
　　 3.细胞凋亡检测：①AnnexinV-FITC和PI双染流式细胞术（FCM）检测不同浓度As2O3处理后MCF-7细胞凋亡率；②Hoechst33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化；4.免疫细胞化学方法（PV法）分别测定各实验组MCF-7细胞IKKβ、FoxO3a、p53及Caspase-3蛋白的表达；5.Western blotting方法测定各实验组MCF-7细胞IKKβ、p-FoxO3a、FoxO3a、p53与Caspase-3蛋白表达。
　　 结果:
　　 1. 细胞凋亡检测结果 ⑴ FCM检测结果显示: As2O3显著增加MCF-7细胞的凋亡，As2O3(2.0μmol/L、4.0μmol/L、8.0μmol/L)作用细胞24h后诱导MCF-7细胞的凋亡率分别为6.26％±0.94％、9.30％±1.63％、13.02％±3.82％，与对照组1.86％±0.70％比较,差异有显著性(P<0.05)，且MCF-7细胞凋亡率与As2O3浓度呈剂量依赖关系(rs=0.949,P<0.05)；⑵ Hoechst33258荧光染色法结果显示: 随着实验组给药浓度的增加荧光染色可见细胞核染色质凝聚、边集、固缩、形成凋亡小体，甚至核碎裂的形态学改变。
　　 2. 免疫细胞化学染色结果显示：⑴ As2O3作用于MCF-7细胞24 h，随着As2O3浓度的增加MCF-7细胞核FoxO3a蛋白表达率逐渐增加，细胞浆FoxO3a蛋白表达率逐渐降低，且Caspase-3蛋白表达率逐渐增加，而IKKβ蛋白表达率下降，各组与阴性对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；⑵ 4.0μmol/L As2O3作用于MCF-7细胞24 h后加入IKKβ激动剂TNF-α刺激细胞2 h，IKKβ蛋白表达率较未刺激组增强，而FoxO3a蛋白胞核表达率较未刺激组下降。各浓度组与阴性对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。
　　 3. Western-blotting检测结果显示：⑴ 不同浓度As2O3作用MCF-7细胞24 h后FoxO3a蛋白表达量增加，p-FoxO3a、IKKβ蛋白表达量下降，而激活型Caspase-3蛋白表达量增加；⑵ 经TNF-α刺激细胞2 h后，IKKβ蛋白表达量较未刺激组增加，而FoxO3a蛋白表达量较未刺激组下降，经相关分析显示两者之间存在负性调节关系；⑶同一浓度As2O3作用于MCF-7细胞随着作用时间的延长，细胞核FoxO3a蛋白表达逐渐增强，胞浆p-FoxO3a蛋白的表达量则逐渐下降。以上各组间及与阴性对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)；⑷ p53蛋白表达量未见明显改变，各组间与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 结论:
　　 1. 不同浓度As2O3均能诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡，且呈剂量依赖关系；As2O3可以通过活化FoxO3a蛋白，抑制p-FoxO3a蛋白的活性，改变其细胞内磷酸化状态，诱导细胞凋亡。
　　 2. FoxO3a活化后可以激活Caspase-3蛋白的表达而促进人乳腺癌MCF-7细胞凋亡。
　　 3. 增加或减少IKKβ蛋白的表达，伴随FoxO3a蛋白表达的减少或增加，显示FoxO3a蛋白的表达受IKKβ的负调控，提示As2O3可以通过下调IKKβ的表达使得FoxO3a蛋白表达上调，从而诱导肿瘤细胞调亡。此有可能是As2O3抗肿瘤作用的一个新的机制。