ROS在戊地昔布诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡中的作用研究

摘要

目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,居女性癌症死因第二位。大量流行病学数据和实验显示非甾体类抗炎药可降低乳癌发病率。研究发现环氧合酶-2(COX-2)在人类所生长的许多恶性肿瘤中呈现过度表达的，许多专家猜测，COX-2可能在肿瘤的发生发展的过程中，起着至关重要的作用，研究显示COX-2选择性抑制剂塞来昔布可抑制大鼠乳癌细胞增生，非甾体类抗炎药物除了抑制COX-2外，还可直接靶向调控其他信号通路，如阻断PI3K/Akt通路。戊地昔布是第二代COX-2选择性抑制剂，对COX-1抑制作用轻，引起的胃肠道等不良反应轻微，对胃癌和肺癌等有明显的抑制作用。这些关于COX-2的研究均表明:假如COX-2呈现的是高表达，那么通过应用COX-2抑制剂，可以起到抑制肿瘤的生长和增殖的作用，从而增强化疗药物和放疗的敏感性。目前多数研究均认为COX-2抑制剂主要通过抑制其活性发挥抗肿瘤作用，但也有一些研究认为通过非COX-2依赖途径。ROS在肿瘤发生过程中起双重作用，尽管ROS可通过造成DNA损伤和激活癌基因的方式促进癌症发生，但ROS的增高也是诱导肿瘤细胞凋亡的原因之一。戊地昔布是选择性COX-2抑制剂，ROS在戊地昔布抗肿瘤中的作用尚未有报道。在此基础上，本研究主要探讨戊地昔布是否通过调控ROS诱导人乳腺癌细胞的凋亡。
　　方法:
　　1.细胞的培养
　　所应用的细胞为人乳腺癌细胞株MCF-7细胞，应用的培养基为含有10％胎牛血清的改良型RPMI1640培养基，培养温度是37℃，并且在5％CO2饱和湿度培养箱中传代培养。
　　2.应用MTT法检测各实验组MCF-7细胞株的生长抑制情况，计算细胞增值抑制率。并检测N-乙酰半胱氨酸，caspase3抑制剂Ac-DEVD-CHO，caspase抑制剂Z-VAD-FMK对戊地昔布作用的影响。
　　3.流式细胞仪检测不同浓度的戊地昔布对MCF-7细胞的凋亡率的影响。
　　收集细胞，约106个/组，PBS洗3次，70％预冷的乙醇固定，PI染液（含质量浓度50 mg·L-1的PI，体积分数1.0％的TritonX-100和质量浓度10 mg·L-1RNaseA)，4℃避光染色30 min，流式细胞仪分析结果。
　　4.Hoechest染色后用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡，用JC-1试剂盒检测戊地昔布对线粒体膜电位的影响，应用活性氧检测试剂盒在激光共聚焦显微镜下检测ROS水平。
　　5.Western blotting免疫印迹方法测定各个实验组caspase-3，cleaved-caspase-3，bax和bcl-2蛋白表达变化情况，用近红外双色激光成像系统分析软件扫描并分析。
　　结果:
　　1.我们用MTT方法检测了不同浓度戊地昔布（浓度分别为:0，25，50，100，200，400μmol·L-1）作用24h、48h、72h后，对MCF-7的生长抑制率进行了对比，不同浓度戊地昔布作用不同时间后对MCF-7的生长抑制作用，戊地昔布可明显抑制MCF-7细胞的增殖，且随时间的延长和浓度的增加，抑制作用显著。
　　2.我们用流式细胞仪检测了0，50，100，200μmol·L-1戊地昔布作用48h后对MCF-7凋亡率的作用。其凋亡率分别为:1.29％、8.53％、15.23％、30.21％。结果表明，戊地昔布可明显诱导MCF-7凋亡，而且，随着浓度增加，凋亡率明显增加(P＜0.05)。
　　3.在激光共聚焦显微镜下观察，应用hoechst33258染色检测戊地昔布诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响，激光共聚焦显微镜下正常细胞核被染成弥散均匀的蓝色，呈圆形。戊地昔布作用后，细胞核染色质浓缩，荧光增强，并呈典型的凋亡形态，可见染色质边聚，形成新月状，MCF-7细胞会出现凋亡，并且应用浓度越大，细胞凋亡率越高。
　　4.激光共聚焦显微镜下直接观测应用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1），实验结果显示，在对照组中我们可以看到很明显的红色荧光，而给予戊地昔布后，红色荧光减弱，绿色荧光增强，这说明戊地昔布可诱导MCF-7细胞线粒体膜电位明显降低。
　　5.激光共聚检测细胞ROS水平，对照组细胞绿色荧光很微弱，给予戊地昔布后可见绿色荧光明显增强，而且随着时间延长，绿色荧光强度明显增加，这就提示给予戊地昔布后可明显提高细胞内ROS水平。给予抗氧化剂N-乙酰基半胱氨酸可明显阻断戊地昔布诱导的ROS升高。我们检测了抗氧化剂N-乙酰基半胱氨酸、caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO、caspase抑制剂Z-VAD-FMK可对戊地昔布作用的影响，结果表明，均可部分拮抗戊地昔布对细胞的生长作用。
　　6.我们检测了戊地昔布对caspase-3，cleaved-caspase-3，bax和bcl-2蛋白表达的影响,给予戊地昔布后,随时间的延长,bax蛋白表达逐渐升高，bcl-2蛋白表达逐渐降低，caspase-3表达先明显升高，然后降低，降解为cleaved-caspase-3。而在对照组我们检测不到cleaved-caspase-3的表达，但给予戊地昔布可看到cleaved-caspase-3明显增多。
　　结论:
　　1.戊地昔布可抑制人乳腺癌MCF-7的生长，诱导其发生凋亡。
　　2.戊地昔布可增加细胞ROS产生，激活caspase-3，降低抗凋亡蛋白bcl-2的表达和增高凋亡蛋白bax表达，这些作用可能参与了其诱导的凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料与试剂

2 实验方法

结果

1 戊地昔布对人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用

2 流式细胞仪检测戊地昔布对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡率的影响

3 在激光共聚焦显微镜下观察，应用hoechst 33258染色检测戊地昔布诱导的人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

4 激光共聚焦检测细胞线粒体膜电位变化

5 激光共聚焦显微镜检测细胞ROS变化

6 抗氧化剂N-乙酰基半胱氨酸，caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO，caspase抑制剂Z-VAD-FMK对戊地昔布作用的影响

7 Western blot检测caspase-3，cleaved-caspase-3，bax和bcl-2蛋白表达变化

附图

讨论

结论

参考文献

综述 COX-2在乳腺癌发生发展的作用及研究进展

致谢

个人简历