银杏叶提取物对6-OHDA诱导PC12细胞凋亡的保护作用

摘要

目的: 研究银杏叶提取物（extract of ginkgo biloba, GBE）对6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine, 6-OHDA）诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤细胞（Rat pheochromocytoma cell line，PC12细胞）凋亡的保护作用及其可能的分子机理。
　　 方法: 经神经生长因子诱导分化的PC12细胞用普通高糖DMEM培养基培养，将培养至对数生长期的细胞分为正常对照组（NS，完全DMEM）, 6-OHDA组（6-OH，100 μmol/L 6-OHDA-完全DMEM）, GBE低剂量组（GL，10 μg/mL GBE-6-OHDA组培养液）, GBE中剂量组（GM，20 μg/mL GBE-6-OHDA组培养液）, GBE高剂量组（GH，40 μg/mL GBE-6-OHDA组培养液）, 左旋多巴对照组（levodopa，L-DP，20 μmol/L L-DOPA-6-OHDA组培养液）。用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT) 比色法测定PC12细胞的活力；流式细胞术测定PC12细胞的凋亡百分比；Hoechst 33342荧光染色观察凋亡细胞核的形态学变化；分光光度法测定胞浆过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）的活性和总抗氧化能力（total antioxidative capability，T-AOC）的水平；免疫印迹法测定胞浆内p53、Bcl-2、Bax以及caspase-3的表达；酶联免疫吸附试验测定胞浆内多巴胺（dopamine，DA）的含量；免疫印迹法和免疫组织化学染色法测定细胞酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）活性的变化。
　　 结果: 与正常对照组相比，6-OHDA组的PC12细胞活力明显降低，细胞凋亡百分比明显升高（P<0.05），较多细胞出现典型的凋亡细胞核的形态学改变。与6-OHDA组相比，GBE低、中、高剂量组的PC12细胞活力增强，细胞凋亡百分比显著降低（P<0.05），且随GBE浓度增加作用更明显，典型的凋亡细胞核也逐渐减少；GM组和GH组CAT, GSH-Px, T-SOD的活性和T-AOC的水平均显著提高 (P<0.05 or P<0.01)，GL组仅T-SOD的活性及T-AOC水平升高，而GSH-Px和CAT的活性无明显变化(P>0.05)，而L-DP对上述抗氧化指标均无明显作用(P>0.05)。GBE还能明显升高PC12细胞TH的活性和胞内DA的含量(P<0.05)。与6-OHDA组相比，GBE低、中、高剂量组Bcl-2的表达增加，Bax的表达降低，Bax/Bcl-2的比值明显降低(P<0.05），p53和caspase-3 的表达降低(P<0.05），且均随GBE剂量增加作用逐渐增强，L-DP组的Bax/Bcl-2的比值以及p53、caspase-3 的表达也有所降低 (P<0.05)。
　　 结论: 6-OHDA能诱发PC12细胞凋亡；GBE能明显抑制6-OHDA诱导的PC12细胞凋亡并对细胞有保护作用；GBE有很强的抗氧化能力，并能明显降低Bax/Bcl-2的比值，抑制p53和caspase-3的活化。由此可见GBE可以通过其抗氧化作用明显改善6-OHDA诱导的氧化应激状态，纠正凋亡调节基因的异常表达及凋亡的重要执行分子caspase-3的异常活化所致的线粒体凋亡信号通路异常，从多环节抑制氧化应激所致的线粒体凋亡通路异常所致的PC12细胞凋亡，研究结果将为银杏叶提取物在临床防治帕金森病提供实验基础。