survivin反义寡核苷酸诱导SGC7901细胞凋亡及增强紫杉醇敏感性的实验研究

摘要

Survivin是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中的一员，是迄今发现最强的凋亡抑制因子之一。对细胞凋亡和分裂周期有双重调控作用：survivin直接作用于caspase，主要抑制凋亡终末效应蛋白caspase-3和caspase-7或干扰caspase-9的活性，阻断由各种刺激诱导的细胞凋亡的共同通路；survivin特异性表达于G2/M期，通过与有丝分裂纺锤体的微管结合，参与对细胞基因的转录调控。由于其具有选择性表达于胚胎和肿瘤组织而在绝大多数正常终末分化组织不表达的特点，可能成为肿瘤诊断的标志物以及肿瘤基因治疗的新靶点。本实验设计高特异性survivin反义寡核苷酸序列，并全程硫代修饰，经脂质体包裹，转染SGC7901胃癌细胞，研究survivin反义寡核苷酸诱导细胞凋亡及增殖抑制作用，以及反义寡核苷酸能否增强胃癌细胞对紫杉醇作用的敏感性，为胃癌的基因治疗提供一个新的的靶点及相关理论依据。
　　 目的: 研究转染生存素(survivin)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide , Asodn)抗肿瘤作用以及是否增强紫杉醇敏感性；并探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制。
　　 方法: 人工合成反义寡核苷酸(Asodn)，经脂质体包裹，将反义寡核苷酸转染SGC7901胃癌细胞，荧光显微镜观察细胞形态变化及转染情况，MTT观察反义寡核苷酸对SGC7901胃癌细胞增殖抑制作用，Westernblot及RT-PCR分别检测survivin蛋白、caspase-3蛋白及survivin mRNA表达，荧光分光光度计检测 caspase-3 活性变化，Hoechst染色观察细胞凋亡形态改变及流式细胞仪检测细胞凋亡率。
　　 结果: ①荧光显微镜及流式细胞仪观察反义寡核苷酸成功转染入SGC7901细胞，荧光显微镜下观察反义寡核苷酸(Asodn)组细胞变圆、折光增强、漂浮、细胞碎片形成等变化，而Control组、Lip组和Sodn组细胞贴壁生长良好，呈梭形；Hoechst染色观察Control组、Lip组和Sodn组细胞核呈正常的蓝色，而Asodn组细胞核染色增强，核质浓缩，核碎裂，呈明显凋亡形态改变。② 用与同浓度、同时间点的Control组、Lip组及Sodn组相比，Asodn组细胞增殖抑制率明显增高(P<0.05)。100~500 nmol/L Asodn 作用24 h、48 h和72 h。后均不同程度的抑制胃癌细胞的增殖，500 nmol/Lasodn作用24 h、48 h、72 h细胞增殖抑制率分别为(47.9±0.8)％、(67.4±0.5) ％和(69.0±3.1)％，作用时间越长，抑制率越高，抑制率与时间呈正相关(r48 h=0.800, P=0.000; r72 h=0.525, P=0.008)；随转染浓度增高，抑制率也增高，抑制率与Asodn浓度呈剂量依赖关系(r500=0.708 P=0.01; r400=0.697, P=0.012; r300=0.895 P=0.000; r200=0.809 P=0.001)。100 nmol/L转染48h时抑制率仅(39.2±5.0)％，500 nmol/L时高达(67.4±0.5)％。③ 与Control组、Lip组、Sodn组比较，Asodn组survivin蛋白及survivin mRNA表达降低，光密度比值均有差异，且有统计学意义(F=807.7, P=0.000; F=658.5, P=0.000)。④ 转染Asodn后caspase-3活性表达增强(F=2963.6, P=0.000)，蛋白表达增加(F=164.7, P=0.000)；⑤ 流式细胞仪检测发现Asodn组凋亡率(14.49±1.21)％明显高于Control组(3.05±0.70)％、Lip组(3.52±0.63)％、Sodn组(3.21±0.82)％ (F=472.3, P =0.000)。⑥ Asodn联合紫杉醇组其增殖抑制率(78.1±0.8％)明显高于单纯Asodn组(54.9±3.6％ )、紫杉醇组(56.7±0.7％)(F=138.3, P=0.000 )；Asodn联合紫杉醇使单独使用紫杉醇细胞凋亡率从(13.16±1.20)％ 提高到(28.52±0.91)％ (F=5505.4, P=0.000 )。提示转染survivin Asodn能增加胃癌细胞对紫杉醇作用的敏感性。
　　 结论: ① 转染survivin反义寡核苷酸能抑制SGC7901胃癌细胞的增殖，抑制率与时间浓度呈依赖关系。② survivin反义寡核苷酸对紫杉醇有增敏作用。③ survivin反义寡核苷酸下调survivin蛋白及survivin mRNA表达。④ survivin 反义寡核苷酸能激活caspase-3表达。⑤ survivin反义寡核苷酸诱导SGC7901胃癌细胞的凋亡。其作用机制可能是通过下调survivin蛋白及survivin mRNA表达，解除survivin对caspase-3的抑制作用，激活caspase-3系统，启动凋亡通路，诱导肿瘤细胞的凋亡。