骨髓间充质干细胞的分离培养及血清浓度对其分化为神经元样细胞的影响

摘要

目的：探讨体外分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells BMSCs)的方法及不同血清浓度对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的影响。动态观察其形态学变化，并分析血清浓度对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响，为骨髓间充质干细胞的移植提供实验依据。
　　方法：1、选取清洁级4周龄SD大鼠，体重120g～200g。采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化骨髓间充质干细胞，并传代扩增，进行形态学观察，采用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。2、将扩增培养至第3代的骨髓间充质干细胞分为6组：第一组(无血清组)，2％B27预诱导72h后，10ng/mlbFGF+10ng/mlEGF正式诱导，其余各组分别加入1％FBS、2％FBS、5％FBS、10％FBS、20％FBS。在倒置显微镜下观察诱导过程中细胞的形态分化，并采用RT-PCR及免疫荧光法对诱导后的细胞进行鉴定。
　　结果：1、运用密度梯度离心法结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠BMSCs，并可稳定传代，表型鉴定结果为CD90、CD29阳性，CD34阴性。2、采用EGF、bFGF可成功诱导BMSCs向神经样细胞分化，诱导过程中细胞形态学发生变化。诱导后BMSCs的胞体变圆，折光率增加，并伸出有2～3支或更多突起。RT-PCR示诱导后BMSCs表达巢蛋白(Nestin)、胶质原性纤维酸性蛋白(GFAP)；免疫荧光染色示诱导后神经细胞的标志物神经烯醇化酶(NSE)以及GFAP表达阳性。3、BMSCs经诱导完成分化后，2％血清组NSE显色最多，GFAP最少，而20％血清组NSE显色最少，2％血清组细胞平均分化率为27.25％，20％血清组平均分化率为13.25％。体外诱导BMSCs向神经样细胞分化时，2％血清浓度可起促进作用，而高浓度血清则起抑制作用。
　　结论：密度梯度离心法结合贴壁筛选法可以有效地体外分离纯化、培养扩增BMSCs，并能稳定传代培养。采用EGF/bFGF方案，能成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞。BMSCs在分化过程中，高浓度的血清抑制向神经样细胞分化，主要起增殖作用；而低浓度血清不仅促进BMSCs增殖而且也可以促进其诱导分化。