siRNA靶向沉默B7-H4基因对人前列腺癌DU145细胞生物学行为的影响

摘要

目的：使用siRNA干扰人前列腺癌DU145细胞B7-H4基因的表达，观察沉默B7-H4基因对DU145细胞增殖、凋亡及侵袭力等生物学行为的影响。为前列腺癌的基因治疗提供实验基础。
　　方法：(1)设计并体外化学合成3对针对人B7-H4基因的特异性siRNA和绿色荧光素标记的FAM-siRNA作为阴性对照序列。(2)利用脂质体(LipofectaminTM2000)将FAM-siRNA转染入人前列腺癌DU145细胞；通过荧光显微镜检测表达绿色荧光素的DU145细胞，评估siRNA转染效率。(3)利用脂质体(LipofectaminTM2000)转染3对siRNA，并设置空白对照组和阴性对照组，收集转染48小时后的DU145细胞提取总RNA和总蛋白，RT-PCR和Western blot技术分别检测B7-H4 mRNA及蛋白表达水平，筛选有效靶点。(4)将筛选出的最佳干扰序列siRNA-3转染DU145细胞，采用CCK-8法检测细胞增殖，Annexin V-PI法检测细胞凋亡情况，Transwell实验检测细胞的侵袭能力。
　　结果：(1)荧光显微镜观察检测显示，FAM-siRNA转染效率大约70％。(2)RT-PCR和Western blot结果显示，与空白组相比，siRNA-2和siRNA-3转染组B7-H4 mRNA和蛋白表达各有不同程度的下调(P<0.05)，其中以siRNA-3转染组下调最明显(P<0.05 vs siRNA-2组)，选为最佳特异性siRNA。(3)CCK-8法检测转染后24h、48h、72h三组细胞增殖水平，根据测定的OD值比较各组细胞的生长情况，发现24h、48h、72h时，siRNA-3组OD与空白组和NC组相比，差异均具有统计学意义(P<0.05)，计算siRNA-3组转染24h，48h和72h抑制率，我们发现72h抑制率最高，为(34.1±2.2)％。(4)流式细胞仪技术测转染后48h三组细胞凋亡率，结果显示：siRNA-3组细胞凋亡率为(28.43±1.29)％，空白组和NC组细胞凋亡率分别为(6.52±0.18)％和(6.74±0.21)％，siRNA-3组较空白组和NC组细胞凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而空白组和NC组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)；(5)Transwell法测转染后24h三组细胞侵袭力，结果显示：siRNA-3组穿过Matrigel胶的细胞数明显少于空白组和NC组(P<0.05)，而空白组和NC组之间无明显差别(P>0.05)。
　　结论：siRNA有效地阻断了前列腺癌Du145细胞中B7-H4基因的表达，B7-H4基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.05)，并抑制细胞的增殖，诱导细胞发生凋亡，同时引起肿瘤细胞侵袭能力减弱。抑制B7-H4基因的表达可能成为临床治疗激素非依赖性前列腺癌的方法之一。