RIP3巯基亚硝基化在缺血性脑损伤中的作用及其分子机制的研究

摘要

目的：在缺血性脑中风中，NMDA受体介导钙离子内流，快速作用于nNOS，产生自由基和NO，使胞内靶蛋白巯基亚硝基化，加重脑损伤。RIP3作为细胞应激传感分子，在调控细胞凋亡、细胞坏死通路中发挥重要作用。但是RIP3在脑缺血中是否引起细胞死亡及其机制尚不清楚。我们的预实验结果显示，大鼠脑缺血再灌注3h小时，RIP3巯基亚硝基化水平明显升高，同时其磷酸化水平也升高。因此，我们提出在脑缺血中，RIP3的活性可能受蛋白质巯基亚硝基化调控的设想：RIP3巯基亚硝基化可促进其自身磷酸化而活化，活化后进一步激活其下游信号分子，加重缺血性脑损伤。本文的目的在于研究RIP3如何发生巯基亚硝基化并鉴定RIP3巯基亚硝基化的位点；研究RIP3巯基亚硝基化与其活性的关系及其调控机制；揭示RIP3巯基亚硝基化对其通路调节的意义；阐明RIP3巯基亚硝基化在缺血性脑中风中作用，从而为治疗缺血性脑损伤提供新的对策和药物作用的潜在靶点。
　　方法：本课题拟以SD大鼠四动脉结扎全脑缺血模型和侧脑室给药等方法进行在体研究，检测RIP3是否参与了脑缺血损伤及以何种形式参与；培养HEK293细胞利用脂质体转染法过表达RIP3野生型质粒及突变体质粒并给予外源性一氧化氮供体(GSNO)，生物素转化法检测过表达目的蛋白的亚硝基化程度并鉴定RIP3的巯基亚硝基化位点；利用RNA干扰技术，特异性降低细胞内RIP3表达；在培养的神经细胞缺糖缺氧/复氧(OGD/reoxygenation)诱导神经元损伤模型中给予不同药物进行体外研究，检测RIP3巯基亚硝基化与其活化的关系，并采用DAPI染色检测神经元细胞的凋亡情况；采用分子生物学、生物化学和组织学等方法，进一步探索RIP3巯基亚硝基化与其磷酸化、活性之间的关系及在缺血性脑中风中的作用。
　　结果：1.在整体水平SD大鼠缺血再灌注不同时间RIP3的亚硝基化发生明显变化，3h时其亚硝基化程度最高，同时检测其磷酸化水平3h时也为最高；通过给予NMDAR拮抗剂MK801、外援性NO供体GSNO、nNOS抑制剂7NI证实RIP3通过NMDAR、nNOS介导其发生巯基亚硝基化。2.在HEK293细胞中过表达RIP3并给予GSNO等药物处理，进一步证实RIP3可以发生巯基亚硝基化。3.以野生型RIP3质粒为模板，通过突变体PCR成功构建出RIP3的9个半胱氨酸突变型质粒。4.在HEK293细胞中分别转染野生型和突变型质粒并给予GSNO处理，成功筛选出承担RIP3亚硝基化的位点为119位半胱氨酸(Cys119)。5.原代神经元细胞在静息状态下检测到RIP3的亚硝基化水平较低，而在OGD/reoxygenation后RIP3亚硝基化程度明显升高，同时其磷酸化水平升高；在此过程中可检测到RIP3与RIP1的结合程度明显变化与其亚硝基化变化相似；而分别给予MK801、GSNO、7NI后再进行OGD/reoxygenation则可以抑制RIP3发生亚硝基化及磷酸化，同时RIP3与RIP1的结合程度也减低。6.利用RNA干扰方法，降低SH-SY5Y细胞内RIP3的表达，检测到这些细胞能够抵制OGD/reoxygenation诱导的神经元损伤。7.在原代神经元细胞中给予抑制RIP3亚硝基化的药物并进行OGD/reoxygenation，DAPI染色结果显示抑制RIP3的亚硝基化能够保护这种OGD诱导的神经元细胞凋亡。
　　结论：RIP3参与脑缺血神经元损伤的过程，此过程中RIP3活性受蛋白质巯基亚硝基化调节；Cys119为RIP3的主要亚硝基化位点；缺血再灌注或OGD/reoxygenation可诱导神经元中RIP3发生巯基亚硝基化而使酶激活，在此过程中抑制RIP3巯基亚硝基化可降低神经元的损伤。