高糖培养下鼠肾小球系膜细胞中BH4的过量生成及其调节机制的研究

摘要

目的：研究高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞( glomerular mesangial cells，MCs)中Janus激酶2(Janus Kinase2，Jak2)和信号转导子和转录激活子1(signal transducers and activators of transcription1，Stat1)表达的变化；进一步探讨Jak2/Stat1通路对GTP环化水解酶1(GTP cyclohydrolase1，GTPCH1)和四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)的影响。
　　 方法：用传代培养的大鼠MCs同步化后分组：正常糖浓度组（NG组，5.56mmol/L葡萄糖）、甘露醇对照组（MA组，5.56mmol/L葡萄糖+19.44mmol/L甘露醇）、高糖组（HG组，25mmol/L葡萄糖）、抗氧化剂组（HG+NAC组，25mmol/L葡萄糖+50μmol/LNAC）、Jak2抑制剂组(HG+AG490组，25mmol/L葡萄糖+10μmol/LAG490)、Statl抑制剂组(HG+Fludarabine组，25mmol/L葡萄糖+50μmol/LFludarabine)、GTPCH1抑制剂组(HG+DAHP组，25mmol/L葡萄糖+2mmol/LDAHP)、过氧化氢组（H2O2组，10-6mol/LH2O2）、过氧化氢联合Jak2抑制剂组（H2O2+AG490组，10-6mol/LH2O2+10μmol/LAG490）、过氧化氢联合Stat1抑制剂组（H2O2+Fludarabine组，10-6mol/LH2O2+50μmol/LFludarabine）、过氧化氢联合GTPCH1抑制剂组（H2O2+DAHP组，10-6mol/LH2O2+2mmol/LDAHP）。溶媒组(HG+DMSO组，25mmol/L葡萄糖+0.1％DMSO;H2O2+DMSO组，10-6mol/LH2O2+0.1％DMSO)。继续培养10h后，采用RT-PCR法测定Jak2和GTPCH1 mRNA水平；Western blot法检测细胞总Jak2(T-Jak2)、磷酸化Jak2(p-Jak2)、总Stat1(T-Stat1)、磷酸化Stat1(p-Stat1)及GTPCH1蛋白的变化；HPLC-FL法检测GTPCH1的活性及细胞内BH4的含量；流式细胞仪检测细胞周期。
　　 结果：所有结果均显示，NG组与MA组比较，HG组与HG+DMSO组比较，H2O2组与H2O2+DMSO组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），其余相关指标变化如下：
　　 1．细胞中BH4含量的变化
　　 与NG组比较，HG组和H2O2组BH4含量均显著增高(P＜0.01)；与HG组比较，HG+NAC组及HG+DAHP组BH4含量均明显降低（P＜0.01）；与H2O2组比较，H2O2+DAHP组BH4含量均明显降低(P＜0.01)。
　　 2．GTPCH1 mRNA水平、蛋白表达以及酶活性的变化
　　 RT-PCR、Westem blot及HPLC-FL结果均显示，与NG组比较，HG组、H2O2组GTPCH1 mRNA水平和蛋白表达以及酶活性较NG组均显著提高（P＜0.01）。与HG组比较，HG+NAC组、HG+AG490组及HG+Fludarabine组GTPCH1 mRNA水平、蛋白表达以及酶活性均显著下降（P＜0.05或P＜0.01）；与H2O2组比较，H2O2+AG490组及H2O2+Fludarabine组GTPCH1 mRNA水平、蛋白表达和酶活性均显著降低(P＜0.01)。
　　 3．Jak2蛋白磷酸化水平的变化
　　 Western blot结果显示，各组间T-Jak2蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。与NG组比较，HG组、H2O2组p-Jak2/T-Jak2值显著(P＜0．01)升高；HG+NAC组结果与HG组比较，p-Jak2/T-Jak2值显著（P＜0.05）降低。
　　 4．Stat1蛋白磷酸化水平的变化
　　 Western blot结果显示，各组间T-Stat1蛋白表达无明显变化（P＞0.05）。与NG组比较，HG组、H2O2组p-Stat1/T-Stat1值显著升高（P＜0.05）；HG+AG490组、HG+NAC组结果与HG组比较，p-Stat1/T-Stat1值显著降低(P＜0.05); H2O2+AG490组结果与H2O2组比较，p-Stat1/T-Stat1值明显降低（P＜0.05）。
　　 5．各处理因素对细胞周期的影响
　　 与NG组比较，HG组及H2O2组，Go/G1期细胞比例均明显升高（P＜0.05），S期细胞比例明显降低（P＜0.05）；与HG组相比，HG+NAC组和HG+DAHP组的Go/G1期细胞比例均显著降低（P＜0.05），S期细胞比例明显升高（P＜0.05）：与H2O2组相比，H2O2+DAHP组Go/G1期细胞比例均有显著降低(P＜0.01)，S期细胞比例明显升高(P＜0.01)。
　　 结论：在本实验条件下得出如下结论：
　　 1．高糖诱导的氧化应激可增加大鼠MCs中BH4的生成，导致Go/G1期细胞增多，S期细胞减少，最终导致细胞肥大。
　　 2．高糖诱导的氧化应激可以导致Jak2/Stat1信号转导通路的激活，激活后的Jak2/Stat1可能进一步促进GTPCH1 mRNA的表达和蛋白的合成，同时提高GTPCH1的酶活性，最终导致BH4的过量生成。

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材料和方法

1 材料

2 方法

结果

讨论

结论

参考文献

一氧化氮在糖尿病肾病中的研究进展 综述

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