Tim-3表达调控慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞功能的研究

摘要

目的：通过研究Tim-3对单核细胞功能的调控作用，进一步揭示慢性乙型肝炎的发病机制，为减轻肝脏炎症和逆转病情进展提供免疫治疗新靶点。
　　方法：1.Tim-3在慢乙肝患者外周血单核细胞中的表达
　　1.1收集慢乙肝患者(CHB)和健康对照者(HC)新鲜外周肝素抗凝血，流式细胞术检测PBMCs中CD14+细胞(单核细胞)表面Tim-3的表达。
　　1.2收集慢乙肝患者(CHB)和健康对照者(HC)新鲜外周肝素抗凝血，通过密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞(PBMC)，在塑料平皿中贴壁2h后获取单核细胞(Mo)，荧光实时定量PCR技术检测Tim-3 mRNA在不同分组Mo中的表达。
　　1.3 CHB患者外周血单核细胞中Tim-3的表达与外周血清炎症水平及病毒指标等进行相关性分析。
　　2.Tim-3通路对LPS诱导CHB患者外周血单核细胞生成炎症因子功能的影响
　　2.1通过密度梯度离心法和贴壁法获取CHB患者外周血Mo，实验分为LPS+Galectin-9组、LPS组和空白组。调整LPS终浓度为1μ g/ml，重组人Galectin-9活性蛋白终浓度为5μg/ml，LPS预先刺激6h后加入重组人Galectin-9活性蛋白共刺激48h。
　　2.2 ELISA法检测各组上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度。
　　2.3细胞内因子染色法结合流式细胞术分别检测各组单核细胞中TNF-α+细胞频数和IL-6+细胞频数。
　　2.4荧光实时定量PCR法检测各组单核细胞中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平。
　　3.Tim-3通路对CHB患者单核细胞诱导Th17细胞分化的影响
　　3.1密度梯度离心法联合贴壁法分离CHB患者外周血单核细胞(Mo)与免疫磁珠分选法分离健康人外周血初始CD4+T细胞(Th0)混合培养6d，实验分为单核细胞+Tim-3阻断抗体组、单核细胞+丙种球蛋白组、单核细胞组和无单核细胞组四组。
　　3.2用ELJSA法分别检测上述各实验分组中细胞培养液上清中IL-17含量。
　　3.3细胞内因子染色结合流式细胞术分别检测上述各实验分组中Th17细胞频数。
　　3.4半定量PCR法分别检测上述各实验分组中IL-17AmRNA表达水平。
　　结果：1.Tim-3在CHB患者外周血单核细胞中表达上调
　　1.1流式细胞术检测结果显示，CHB组外周血CD14+Tim-3+细胞频数显著高于HC组(X2=144.40，P<0.01)。
　　1.2荧光实时定量PCR技术检测结果显示，CHB组单核细胞中Tim-3 mRNA的表达显著高于HC组(t=1.84，P=0.040)。
　　1.3统计学分析发现，CHB组中CDl4+Tim-3+％与外周血清ALT水平成正相关(r=0.362，P=0.028)，而与HBV DNA滴度、HbeAg状态无明显相关性。
　　2.Tim-3通路可促进LPS刺激单核细胞生成炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)
　　2.1 Tim-3通路促进LPS诱导CHB外周血单核细胞生成TNF-α统计学分析ELISA结果示LPS组细胞培养上清中TNF-α浓度显著高于空白组(P=0.036)，LPs+Galectin-9组细胞培养上清中TNF-α浓度显著高于LPS组和空白组(P=0.037，P=0.003)，差异均有统计学意义。利用2-△△Ct比较法分别检测各实验组中单核细胞TNF-α mRNA的相对表达，统计学分析结果示LPS+Galectin-9组中TNF-α mRNA的表达量显著高于LPS组和空白组(P=0.044，P=0.037)，且LPS组TNF-α mRNA表达量也显著高于空白组(P=0.001)，差异均有统计学意义。流式细胞术结果显示LPS+Galectin-9组CD14+TNF-α细胞频数显著高于空白组(P=0.004)，差异有统计学意义，而与LPS组之间的差异无统计学意义(P=0.563)。
　　2.2 Tim-3通路促进LPS诱导CHB外周血单核细胞分泌IL-1β2-△△Ct比较法结果显示LPS+Galectin-9组IL-1β mRNA的相对表达量显著高于LPS组和空白组(P=0.026，P=0.014)，差异均有统计学意义。ELISA结果类似。
　　2.3 Tim-3通路促进LPS诱导CHB外周血单核细胞分泌IL-6 ELISA法检测上清液中IL-6含量，结果示LPS及Galectin-9共刺激时IL-6水平明显高于LPS组和空白组(P=0.014，P=0.000)，差异均有统计学意义。荧光实时定量PCR检测IL-6 mRNA表达量，2-△△Ct比较法结果类似：LPS+Galectin-9组显著高于LPS组和空白组(P=0.035，P=0.028)。流式细胞术结果显示LPS+Galectin-9组和LPS组CD14+IL-6+细胞频数均显著高于空白组(P=0.033，P=0.019)，而CD14+IL-6+细胞频数在LPS+Galectin-9组和LPS组之间的差异无统计学意义(P=0.894)。
　　3.阻断单核细胞Tim-3通路可下调其对Th17细胞分化的诱导作用
　　3.1细胞内细胞因子染色法结合流式细胞术分别检测各实验组中Th17细胞频数本实验认定CD3+CD8-IL-17+细胞为Th17细胞。无Mo组中Th17细胞频数显著低于Mo组和Mo+丙球组(P=0.002，P=0.004)，差异均有统计学意义。Mo+Tim-3阻断抗体组中Th17细胞频数显著低于Mo组和Mo+丙球组(P=0.009，P=0.020)，差异均有统计学意义。
　　3.2半定量PCR法分别检测各实验组中IL-17 mRNA的相对表达量结果使用BandScan软件进行半定量分析，IL-17与β-actin的灰度值进行对比获得IL-17电泳条带的相对灰度值。统计学结果显示：Mo+Tim-3阻断抗体组中IL-17mRNA的相对表达量均显著低于Mo组和Mo+丙球组(P均<0.01)，差异均有统计学意义。无Mo组中IL-17mRNA的相对表达量均低于Mo组和Mo+丙球组，差异均有统计学意义(P均<0.01)。
　　3.3 ELISA法检测各组细胞培养上清中IL-17含量结果显示无Mo组细胞培养上清中IL-17浓度显著低于Mo组、Mo+丙球组和Mo+Tim-3阻断抗体组(P=0.019，P=0.005，P=0.004)，差异均有统计学意义；Mo+Tim-3阻断抗体组细胞培养上清中IL-17浓度低于Mo组和Mo+丙球组(P=0.049，P=0.014)，差异均有统计学意义。
　　结论：1.CHB患者外周血单核细胞表面Tim-3分子表达升高，并且与外周血清ALT水平成正相关，提示单核细胞上调Tim-3的表达可能参与慢性乙型肝炎的炎症过程。
　　2.Tim-3/Galectin-9通路对LPS刺激单核细胞引起单核细胞的活化具有促进作用，增加促炎因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的产生，从而促进炎症反应。
　　3.单核细胞能在体外诱导人Th17细胞的分化。
　　4.体外阻断单核细胞Tim-3通路可抑制Th0细胞向Th17细胞的分化。