木犀草素对血管紧张素Ⅱ刺激的内皮细胞诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移的抑制作用及其机制研究

摘要

目的：本实验拟在细胞水平探讨血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)刺激的血管内皮细胞(vascular endothelial Cells，VECs)与血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells，VSMCs)非接触式共培养促进VSMCs增殖和迁移的作用，观察木犀草素(Luteolin，Lut)是否可以通过抑制AngⅡ诱导的VECs功能障碍从而阻断共培养体系中VSMCs的增殖和迁移，并对其作用机制进行初步探讨。
　　方法：1、人脐静脉内皮细胞株(HUVEC-C，购自ATCC)。2、组织贴块法培养大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)，并进行平滑肌α-肌动蛋白(SM-α actin)免疫组化鉴定，取3～5代细胞进行实验。3、建立VECs/VSMCs非接触式共培养体系，AngⅡ刺激的VECs种于下室，VSMCs种于上室。实验分组为(1)VECs/VSMCs对照组；(2)AngⅡ组；(3)Lut浓度梯度组(12.5μ M、25μ M、50μ M)；(4)Ly294002组(10μ M)。4、细胞计数法检测共培养体系中VSMCs的迁移；噻唑蓝(3-(4，5，-dimethylthiazol-2-yl)-2，5，-diphenyl，MTT)比色法检测共培养体系中VSMCs的增殖；免疫印迹实验(Western blotting)测定TotalAkt，Phospho-Akt，VEGF，NOX4蛋白表达的情况；ELISA试剂盒测定细胞上清VEGF水平。
　　结果：1、原代培养的VSMCs生长良好，光镜下呈长梭形及“峰与谷”样生长。SMα-actin免疫组化的结果显示培养的细胞具有典型的VSMCs特征。2、AngⅡ刺激的VECs能明显促进共培养体系中VSMCs的增殖和迁移，Lut预处理能显著抑制VSMCs的增殖和迁移，以50uM最为显著。Ly294002预处理办能显著抑制VSMCs的增殖和迁移。3、AngⅡ可明显促进VECs表达Phospho-AKT、VEGF、NOX4蛋白。Lut能显著抑制VECs表达Phospho-AKT、VEGF、NOX4蛋白，各浓度组时间组间差异显著；Ly294002亦可显著抑制Phospho-AKT、VEGF蛋白的表达。4、VEGF含量Elisa法检测结果显示：VECs有基础VEGF分泌，AngⅡ可诱导VECs分泌VEGF。Lut和Ly294002均可以抑制AngⅡ诱导VECs分泌VEGF。
　　结论：1、Lut显著抑制AngⅡ诱导的VECs/VSMCs共培养体系中VSMCs的增殖和迁移。2、Lut显著抑制AngⅡ诱导的内皮细胞中NOX4的表达，提示其可能通过抑制NOX4表达阻断ROS的产生发挥抗内皮细胞功能障碍的作用。3、Ly294002能抑制AngⅡ诱导内皮细胞VEGF蛋白表达并显著抑制共培养体系中VSMCs增殖和迁移，提示AngⅡ可通过P13K/AKT通路诱导VEGF的表达，表明AngⅡ-PI3K/Akt通道及VEGF在VECs功能障碍与VSMCs增殖和迁移的对话中起着重要的作用。Lut显著抑制VECs中VEGF及p-Akt蛋白的表达，提示Lut可以此为靶点发挥抗AS的作用。