rhGLP-1(7-36)对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及机制研究

摘要

文章主要从以下几方面进行了论述。
　　第一部分SD大鼠2型糖尿病模型的建立。
　　目的:建立类似于人类2型糖尿病病理生理特征的大鼠糖尿病模型，为后期实验提供2型糖尿病动物模型。
　　方法：采用高脂饲料喂养4周诱导胰岛素抵抗，再用腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)诱导胰岛损伤的方法建立糖尿病模型;将大鼠随机分成普通饲料饲养的正常对照组，高脂饲料喂养的模型对照组和模型组;Lee's指数评价肥胖程度;ELISA法测定血浆胰岛素(INS)，甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)及游离脂肪酸(FAA);血糖仪测定血糖，成模标准为空腹血糖≥11.0 mmol/L;SPSS16.0进行统计分析，P＜0.05表明差异有统计学意义。
　　结果：与正常对照组相比，高脂饲料组在喂养4周后出现肥胖、胰岛素抵抗及血脂代谢紊乱，模型组给予STZ后出现多饮多尿，体重减轻等现象，以及空腹血糖升高，胰岛素敏感性指数降低等生化改变;造模成功率为50％，死亡率为7.41％。
　　结论：本实验采用的造模方法，成功建立了符合临床2型糖尿病特点的动物模型。
　　第二部分HPLC/MS/MS法测定大鼠脑内EAAs含量方法学建立。
　　目的：采用HPLC/MS/MS技术建立一种快速、灵敏、准确的检测脑组织内兴奋性氨基酸的实验方法。
　　方法：采用Agilent1200型高效液相色谱系统和AB SCIEX QTRAP5500型三重四级杆串联质谱系统;以HYPERSIL GOLD为预柱，Restek C18为分离柱，流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，A∶B=40∶60等梯度洗脱;质谱分析条件为阳离子模式下多重反应监测（MRM），用于定量分析的GLU离子为m/z142.1→84.1，ASP离子为m/z134→74，内标(GLU-d5)为m/z153.1→88;采用Analyst1.5.2进行数据定量分析，SPSS16.0进行统计分析，检验水准α=0.05，P＜0.05表明差异有统计学意义。
　　结果:GLU、ASP、GLU-d5的保留时间分别为1.63 min、2.33 min、1.61 min，分离度好，峰形良好，无杂质峰干扰;在10～1000 ng/ml标准曲线范围内，线性良好，r2大于0.99，定量下限为10 ng/ml; GLU和ASP的日内精密度(RSD)分别为1.0％～11.0％和2.0％～12.0％,日间精密度(RSD)分别为4.0％～5.0％,3.0％～5.0％,准确度分别为88.4％～116.0％和85.8％～116.0％;在10 ng/ml、100 ng/ml、1000 ng/ml浓度下，回收率分别为0.79±0.24、1.01±0.10、0.90±0.12和0.99±0.26、0.93±0.07、1.13±0.13;GLU和ASP的稀释效应为11.59±2.29％和10.81±1.73％;样本室温条件下稳定。
　　结论：该分析方法的特异性、线性、灵敏度、准确度均符合生物样品质量分析要求，稀释效应对检测结果基本无影响，在本实验室环境下可用于定量检测大鼠脑组织内兴奋性氨基酸含量。
　　第三部分 rhGLP-1(7-36)对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及机制研究
　　目的：1.考察rhGLP-1(7-36)对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤的脑保护作用疗效;2.初步探讨rhGLP-1(7-36)发挥脑保护作用的机制。
　　方法：通过高脂饲料饮食加小剂量STZ诱导胰岛损伤的方法建立SD大鼠2型糖尿病模型，再在糖尿病模型的基础上建立MCAO/R模型，将糖尿病合并MCAO/R模型组大鼠随机分为假手术组，模型对照组，尼莫地平组，胰岛素组，rhGLP-1(7-36)低、中、高剂量组，通过观察大鼠给药后神经功能缺损评分改善程度，TTC染色后各组大鼠脑梗死面积，以及HE染色观察各组大鼠脑组织病理形态改变来评价rhGLP-1(7-36)的脑保护作用;测定各组大鼠给药后30 min血糖变化，来评价rhGLP-1(7-36)的降糖疗效;通过ELISA法测定脑组织内SOD、MDA、GSH-PX、iNOS、eNOS含量变化，HPLC/MS/MS法来测定脑组织内GLU、ASP含量变化来探讨rhGLP-1(7-36)发挥脑保护作用的机制;用SPSS16.0对数据进行统计分析，P＜0.05表明差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.rhGLP-1(7-36)对糖尿病合并MCAO/R大鼠神经功能评分影响
　　手术成功大鼠出现偏瘫症状，与模型对照组比较，尼莫地平组、胰岛素组、rhGLP-1(7-36)中、高剂量组在数值上均有改善神经功能缺损状态的趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　2.rhGLP-1(7-36)对脑梗死面积影响
　　与模型对照组比较（vs.31.90±7.86％），尼莫地平组（21.10±19.82％，P＜0.05）、胰岛素组（14.68±11.58％，P＜0.05）、rhGLP-1(7-36)中剂量组（13.54±8.64％，P＜0.01）、高剂量组（16.97±15.74％，P＜0.01）均能减少脑梗死面积;rhGLP-1(7-36)各组与尼莫地平组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　3.rhGLP-1(7-36)对脑组织病理影响
　　rhGLP-1(7-36)各组与模型对照组相比，脑组织水肿空泡数量明显减少，尼氏小体数目增多，排列更加规律，紧密，血管增生增加。
　　4.rhGLP-1(7-36)对血糖的影响
　　与模型对照组相比，rhGLP-1(7-36)高剂量组给药后30 min血糖下降最显著（P＜0.01），与胰岛素组比较，rhGLP-1(7-36)低剂量组血糖下降程度低（P＜0.01），中、高剂量组与胰岛素组差异无统计学意义。
　　5.rhGLP-1(7-36)对脑组织内SOD、MDA、GSH-PX、iNOS、eNOS的影响
　　与模型对照组比较，rhGLP-1(7-36)中、高剂量组脑组织内SOD活性显著增加（P＜0.01），与尼莫地平组比较，rhGLP-1(7-36)中、高剂量组增高更显著(P＜0.05，P＜0.01);rhGLP-1(7-36)低、中、高剂量组GSH-PX活性较模型对照组升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01)，较尼莫地平组升高更显著（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）;rhGLP-1(7-36)低、中、高剂量组较模型对照组，MDA含量降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），较尼莫地平组rhGLP-1(7-36)高剂量组下降更为明显(P＜0.01); rhGLP-1(7-36)低、中、高剂量组较模型对照组，iNOS活性降低（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），较尼莫地平组差异无统计学意义;rhGLP-1(7-36)高剂量组较模型对照组，eNOS活性升高(P＜0.05)。
　　6.rhGLP-1(7-36)对脑组织内兴奋性氨基酸含量的影响
　　与模型对照组比较，rhGLP-1(7-36)中、高剂量组脑组织内GLU含量降低（P＜0.05，P＜0.05），与尼莫地平组比较差异无统计学意义;与模型对照组比较，胰岛素组ASP含量下降最为明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论：
　　1.rhGLP-1(7-36)能改善糖尿病合并脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能缺损状况，减轻脑组织损伤，对脑缺血再灌注损伤有保护作用。
　　2.rhGLP-1(7-36)能够降低血糖，从而达到治疗糖尿病的作用。
　　3.rhGLP-1(7-36)能够增加脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织内SOD、GSH-PX、eNOS活性，降低iNOS活性，降低MDA、GLU含量，从而抑制氧化应激损伤，抑制NO损伤，抑制兴奋性氨基酸毒性作用，减轻脑缺血再灌注损伤。

目录

研究生个人简介

缩略词表

第一部分 SD大鼠2型糖尿病模型的建立

摘要

前言

材料和方法

1．实验材料及试剂

2．实验方法

结果

1．大鼠—般情况

2．血糖变化

3．血浆TG、FAA、TC变化

4．胰岛素变化

讨论

结论

参考文献

第二部分 HPLC／MS／MS法测定大鼠脑内EAAs含量方法学建立

摘要

前言

材料与方法

1．试剂

2．溶液配制

3．仪器和色谱／质谱条件

4．实测时脑组织样品处理

5 数据处理及统计分析

结果

1．特异性

2．标准曲线及定量范围

3．精密度和准确度

4．基质效应和回收率

5．稳定性和稀释效应

讨论

结论

参考文献

第三部分 rhGLP-1(7-36)对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护作用及机制研究

摘要

前言

材料与方法

1．实验材科及试剂

2．实验分组及方法

结果

1．rhGLP-1(7-36)对神经功能评分的影响

2．rhGLP-1(7-36)对脑梗死面积影响

3．脑组织病理改变

4．血糖变化

5．脑梗死生化指标

6．脑组织内兴奋性氨基酸含量变化

讨论

1．糖尿病合并脑缺血再灌注损伤模型的建立

2．rhGLP-(7-36)对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤大鼠的脑保护及降糖作用评价

3．rhGLP-1(7-36)对糖尿病合并脑缺血再灌注损伤大鼠脑保护作用机制探讨

结论

参考文献

第四部分 脑缺血再灌注损伤研究进展及GLP-1受体激动剂与脑缺血再灌注损伤的关系

攻读硕士学位期间发表学术论文

致谢

声明

论文审阅认定书