绢丝昆虫线粒体DNA A+T丰富区序列的克隆与分子进化分析

摘要

家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目的一种重要模式昆虫，对其起源和分化的研究一直受到蚕业科学界的高度重视，并随着科学技术的进步和考古发现而不断推向深入，取得了很大的进展。家蚕的中国起源学说已经成为学界的共识，然而对于家蚕起源的地域性和化性分化却一直存在着争论，形成了两种不同的学说：家蚕起源黄河流域的“一中心”学说和多地域起源的“多中心”学说。 动物线粒体DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）具有分子量小、便于实验操作、变异速度快和母性遗传等特点，被广泛用于种群遗传和物种分子进化分析。mtDNA控制区（D-环）因富含腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T），被称为A+T丰富区，是动物线粒体基因组序列和长度变异最大的区域。利用线粒体DNA基因组中保守性的蛋白质编码基因或rRNA基因等序列分析家蚕和蓖麻蚕（Philosamia cynthia ricini）等绢丝昆虫系统发育和分子进化已有较多报道，但是鲜见用线粒体基因组A+T丰富区分析家蚕等绢丝昆虫的进化。 本研究选择12个家蚕品种以及镇江野桑蚕（Bombyx mandarina Zhenjiang strain）、蓖麻蚕、樗蚕（Philosamia cynthia cynthia）和柳蚕（Actias selene ningdoana）为材料，分别从蛹体中提取线粒体DNA。家蚕品种分别为：三四、大草、邯郸种、迈索尔、大造、萨尼斯、余杭二化、沿河1号、新昌12号、安康4号、甘肃种、兰5，从化性上分包括一化性、二化性和多化性品种，从地理系统上划分包括中国系统、日本系统、欧洲系统和热带系统，从茧色上划分包括白色、橘红色、淡橘红色、金黄色、淡黄绿色。根据已发表的家蚕和野桑蚕mtDNA控制区及其侧翼序列，设计1对PCR引物，用PCR方法克隆线粒体A+T丰富区及其侧翼序列，并进行序列测定。 序列分析表明，家蚕品种克隆片段平均长度约1.1 kb，镇江野桑蚕的克隆片段为1085 bp，蓖麻蚕、樗蚕和柳蚕该区段长度分别为951 bp、952 bp和930 bp，它们的基因排列顺序均与家蚕品种C108相同，依次为12S rRNA基因3′ 端、A+T丰富区、tRNA-Met、tRNA-Ile、tRNA-Gln和ND2基因5′ 端，在tRNA-Gln和ND2基因之间有一段非编码区。家蚕品种的克隆片段及C108和青熟（Aojuku）间核苷酸序列的同源性均在99％以上，其中C108、兰5和青熟三者完全一致；沿河1号和大造与C108相比，只在控制区的T-串（Thymine-stretch）和A-串（Adenine-stretch）长度上有1-2个碱基的差异；在14个品种中，共检测到19个碱基替换（15个转换，4个颠换）和6个碱基缺失，主要分布在A+T丰富区。 为了研究家蚕品种的起源以及家蚕和大蚕蛾科绢丝昆虫的亲缘关系，我们以黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）线粒体DNA为外群，分别采用Phylip3.66软件包的邻位相连法（DNA NJ）和最大可能性法（DNA ML），构建了基于14个家蚕品种和4个野桑蚕品系mtDNA A+T丰富区及其侧翼序列的进化树和基于2个家蚕品种和柞蚕（Antheraea pernyi）、蓖麻蚕、樗蚕、柳蚕4种5个品系的大蚕蛾科绢丝昆虫mtDNA A+T丰富区序列的进化树。在前一进化树中，14个家蚕品种与2个中国野桑蚕聚为一亚群，而2个日本野桑蚕单独聚为另一亚群，说明家蚕品种与中国野桑蚕的亲缘关系更近、与日本野桑蚕（Japanese Bombyx mandarina）较远；在14个家蚕品种中，甘肃种的进化早于其它品种，说明甘肃种是本试验研究中进化最早的家蚕品种。在后一进化树中，柳蚕与蓖麻蚕、樗蚕三者的亲缘关系较近，与柞蚕的亲缘关系较远，与家蚕的亲缘关系更远；在所研究的绢丝昆虫中蓖麻蚕和樗蚕的亲缘关系最近。 本研究结果在线粒体基因组水平上为家蚕起源于中国古野桑蚕和黄河流域是家蚕品种的发祥地之一，提供了新的证据。