绢丝昆虫柳蚕异柠檬酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

摘要

异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）是生物中一种重要的有脱羧作用的氧化还原酶，在生物中有NAD-依赖型的异柠檬酸脱氢酶和NADP-依赖型的异柠檬酸脱氢酶两种形式。异柠檬酸脱氢酶不仅在氨基酸和维生素合成、能量代谢中扮演重要角色，而且在三羧酸循环和乙醛酸旁路的碳通量分配中起关键性调控作用，因此异柠檬酸脱氢酶是国际上公认的研究蛋白质结构与功能、酶的催化与调节机制、代谢途径最好模型之一。
　　 近期对IDH的研究很多，包括：NADP-IDH的生物学特性中的底物及辅酶专一性，金属离子的影响，最适pH、最适温度及热稳定性，化学修饰剂等以及NADP-IDH的空间结构特点，NADP-IDH的调节、催化等作用机制。这些研究为我们更清楚的认识其在生物体代谢和功能等方面的作用提供了较好的理论依据。
　　 到目前为止，人，小鼠，斑马鱼，果蝇，恶性疟原虫，家蚕，大豆等的NADP-异柠檬酸脱氢酶序列已进行了解析，它们的异柠檬酸脱氢酶具有一定的同源性，为了弄清柳蚕异柠檬酸脱氢酶序列的特性及其与其它物种的关系，从而能够更加系统的研究异柠檬酸脱氢酶的特点，更好地开发利用柳蚕资源，根据已报道的NADP-异柠檬酸脱氢酶基因的保守性序列设计引物，从柳蚕蛹脂肪体中提取RNA，并反转录成cDNA为模板进行基因克隆、测序。获得的柳蚕NADP依赖性异柠檬酸脱氢酶序列全长1317bp，编码439个氨基酸，含有异柠檬酸脱氢酶保守性结构，与家蚕异柠檬酸脱氢酶的氨基酸序列同源性达95％，这也从另一方面证明了柳蚕与家蚕两者之间的进化关系。选择柳蚕转录延长因子为内参，并提取柳蚕蛹中的头、血液、精巢、脂肪体的RNA并反转录，半定量PCR检测结果表明，异柠檬酸脱氢酶在蛹不同组织中均有表达，表达量没有显著差异，这与异柠檬酸脱氢酶广泛的生物学功能是一致的。试验所解析的柳蚕NADP-异柠檬酸脱氢酶序列已登录GenBank，登录号为FJ959347。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述

1.概述

1.1异柠檬酸脱氢酶与柠檬酸循环

1.2异柠檬酸脱氢酶的分类及其性质

1.3国内外研究进展

2.本研究的目的和意义

3.研究的基本技术路线

1引言

2材料和方法

2.1柳蚕异柠檬酸脱氢酶的克隆及序列分析

2.1.1供试材料

2.1.2主要的仪器设备

2.1.3主要生化试剂及常用溶液的配制

2.1.4柳蚕组织的提取

2.1.5脂肪体总RNA的抽提

2.1.6脂肪体总RNA的检测

2.1.7 cDNA第一链的合成

2.1.8 PCR反应成分及程序

2.1.9反转录及3’RACE方法克隆柳蚕NADP-异柠檬酸脱氢酶cDNA

2.1.10 PCR产物的纯化

2.1.11感受态细胞的制备

2.1.12连接和转化

2.1.13测序

2.1.14序列拼接与分析

2.2半定量PCR检测柳蚕异柠檬酸脱氢酶基因在不同组织中的表达

2.2.1供试材料柳蚕蛹血液、头、精巢RNA的抽提

2.2.2总RNA的检测

2.2.3 cDNA第一链的合成

2.2.4引物选择

2.2.5 PCR反应成分

2.2.6循环数目的优化

2.2.7 PCR反应程序的程序

3结果与分析

3.1柳蚕NADP-IDH的克隆及序列分析结果

3.1.1脂肪体总RNA的抽提

3.1.2 PCR扩增结果分析

3.1.3菌落PCR结果

3.1.4柳蚕异柠檬酸脱氢酶序列分析

3.1.5序列同源性比较

3.1.6系统发生树的建立

3.1.7柳蚕异柠檬酸脱氢酶结构分析

3.2异柠檬酸脱氢酶在不同组织中的表达分析

3.2.1不同组织内RNA的提取

3.2.2循环数目的优化

3.2.3不同组织内异柠檬酸脱氢酶的表达情况分析

4讨论

5结论

参考文献：

致谢

个人简介

读研期间发表的论文