基于ITS分子标记的木霉抗病性研究及β-1,3-glucanase基因片段的克隆

摘要

木霉(Trichoderma)是一类普遍存在且易于分离培养的丝状真菌,是土壤微生物的重要组成群落之一。在木霉中有一类具有抑制病原真菌生长特性的特殊类群,被称作拮抗木霉。实验室于2007年已筛选出22株对常见病原菌具有优良抗性的木霉菌,本实验在此基础上采用平板对峙法补全了这22个菌株的抗病信息。然后以实验室保存的86株木霉属真菌和上述22株木霉菌为实验材料,开展基于ITS分子标记的木霉多样性分析、木霉拮抗不同病原菌的差异及β-1,3-葡聚糖酶基因片段克隆的研究,获得的主要研究结果如下:
　　1)通过平板对峙法对22个菌株中前人未完全研究清楚的6株木霉菌进行抗性筛选,结果显示,有72.22％的对峙组合中木霉菌对病原菌表现出50％以上的抑制率,说明供试木霉菌株对9种常见病原菌具有较好的抗性。综合22株木霉菌的抗病信息结果得出,不同木霉菌株对同一病原菌或同一木霉菌株对不同病原菌的抑制作用均表现出不同程度的差异。
　　2)采用PCR-RFLP方法对木霉属菌株进行系统发育分析。用引物ITS1/ITS4对该属15种86个菌株的ITS(Internal Transcribed Spacer)进行了PCR扩增,2种限制性内切酶(HaeⅢ、HinfⅠ)分别酶切。结果显示:通过2个限制性内切酶酶切共获得19条清晰易辨的多态性DNA条带。其中HaeⅢ限制性酶切获得8个多态性DNA条带,将供试菌株分为6种类型;HinfI获得11个多态性DNA条带,将供试菌株分为9种类型,后者的多态性更加明显。其中哈茨木霉(T.harzianum)ACCC30371的图谱最为特殊,无论是用HaeⅢ还是HinfⅠ酶切,该菌株的酶切图谱都是最特殊的,说明该菌株在进化过程中的地位可能比较特殊。
　　3) ITS PCR-RFLP得到的19条多态性DNA条带以某一片段在某样品中出现赋值“1”和不出现赋值“0”为依据进行数据处理,运用NTSYS-PC软件,UPGMA(Unweighed Pair Group Method with Arithmetic Mean)法生成聚类图。供试86株木霉属菌株可分为21类,多态性较高,聚类结果基本符合Gams和Bissett依据形态学性状对木霉的分类结果。
　　4)设计简并引物,以22株抗病优良木霉菌株(A组)和13株抗病一般菌株(B组)为材料,利用Touch-down PCR的方法克隆获得目的片段,用NCBI中的BLASTx功能进行比对,鉴定出19个A组和4个B组木霉菌株的β-1,3-葡聚糖酶基因保守片段,将这些片段推导成氨基酸序列,进行氨基酸序列的多序列联配比对及同源性分析,结果显示,已获得基因片段的23株木霉菌,它们的氨基酸序列同源性在40.7％～100％之间,在氨基酸位点60～80和89～100处最为保守。本研究为进一步克隆该基因的全长及筛选高酶活基因型奠定了基础。

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Contents

注 释 表

第1章 绪 论

1.1 研究背景和选题意义

1.2 本课题主要研究内容

第2章 拮抗木霉菌株的室内抑菌活性测定

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 本章小结

第3章 基于ITS PCR-RFLP技术木霉菌聚类分析及抗病性分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

第4章 β-1,3-葡聚糖酶基因片段的克隆

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5 本章小结

结 论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢