梅花鹿生茸区骨膜干细胞Galectin-1基因RNAi重组慢病毒载体的构建

摘要

当代,随着养鹿产业的快速发展,鹿肉在欧洲很多国家已成为一种餐桌食品,但在一些东南亚国家例如中国、日本等,人们更注重的是鹿茸的价值。鹿茸在中医药学中具有提高机体免疫力、抗衰老、促进创伤愈合和骨质修复等作用,被广泛的用于治疗或滋补。鹿茸是哺乳动物中唯一能周期性完全再生的附属器官,是研究哺乳动物器官修复及再生的绝佳生物模型。鹿茸的再生源于生茸干细胞,最快生长速度可以达到1～2cm/d,媲美癌细胞,但高速的生长并未使鹿茸发生癌变,这为癌症的研究提供了新的医学模型。
　　Galectin-1(半乳糖凝集素1)分子量约为14kDa,是一种糖结合蛋白,动物凝集素家族的成员之一。Galectin-1(Gal-1)与神经修复、血管再生、软骨形成等多个生物过程相关,现阶段对它的研究主要集中在癌变过程中,也有其在胚胎发育过程中的研究报道。鹿茸的再生过程涉及了神经、血管、软骨、皮肤等的生长,研究表明,Gal-1在生茸干细胞中的表达量与普通细胞中的不同,在两种生茸干细胞之中的表达量也不相同。令人感兴趣的是,Gal-1在生茸干细胞中的大量表达并未引起鹿茸的癌变,也就是说,研究Gal-1在鹿茸再生机制中的作用十分重要的。
　　本实验采用慢病毒载体介导的RNAi(RNAinterference)技术,以生茸区骨膜干细胞为研究对象,为后期在离体条件下探讨Gal-1在鹿茸血管、神经、软骨形成中的作用及活体研究打下基础。总体实验设计如下:利用在线设计软件、通用设计法则及文献报道进行RNAi高分靶位点的筛选,使用NCBI中的Blast工具除去脱靶效应(offtarget)情况。根据实验室经验设计shRNA(短发夹RNA)寡核苷酸链,进行化学合成。将化学合成的shRNA正义链和反义链进行体外退火,使其形成双链,并插入经过酶切的载体质粒进行重组连接。对重组质粒进行PCR初步鉴定,测序进一步鉴定;将重组成功的载体质粒pLVTHM及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G,进行无内毒素的大量提取,使用罗氏转染试剂,共转染293t细胞,分别在24h和48h时收集、浓缩病毒。将采集的生茸区骨膜进行细胞原代培养,利用浓缩病毒液感染生茸区骨膜干细胞,并在72h后利用倒置荧光显微镜观察感染效果。
　　结果:首先,成功筛选出2条针对梅花鹿Gal-1基因的RNAi高分靶位点,成功将化学合成的shRNA正义链与反义链进行体外退火形成双链核苷酸链;其次,根据实验需要成功重组了载体质粒pLVTHM;然后,利用慢病毒三质粒系统成功转染了293t细胞,获得了大量的重组慢病毒粒子;同时,成功对生茸区骨膜干细胞进行了原代培养,并获得感染成功的生茸区骨膜干细胞。结论:本实验成功构建出针对梅花鹿Gal-1基因的慢病毒载体,获得大量的浓缩病毒液且成功感染鹿生茸区骨膜干细胞,获得了能够遗传的,Gal-1有效沉默的生茸区骨膜干细胞系,为Gal-1基因的功能研究打下了基础。

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英文缩略表

第1章 绪论

1.1 引言

1.2 研究背景

1.3 研究的目的及意义

1.4 研究内容

第2章 Gal-1基因重组慢病毒载体的构建及鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 本章小结

第3章 重组慢病毒的获得

3.1 实验材料

3.2 实验仪器

3.3 实验方法

3.4 实验结果

3.5 讨论

3.6 本章小结

第4章 生茸区骨膜干细胞原代培养及重组慢病毒的感染

4.1 实验耗材

4.2 实验仪器

4.3 实验步骤

4.4 实验结果

4.5 讨论

4.6 本章小结

第5章 结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢