果蝇和家蚕中ELAV RNA结合蛋白家族的研究

摘要

在多细胞生物中，转录、转录后和翻译水平的调控在基因表达过程中具有重要作用。RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一类重要的转录及转录后调控因子，主要通过一个或多个RNA结合区域，与单链或双链RNA结合，参与基因表达的多种调控过程。ELAV/Hu是一类含有3个RRMs、高度保守的神经细胞RNA结合蛋白家族。双翅目昆虫果蝇中，该蛋白家族包括ELAV、RBP9和FNE，其中ELAV主要参与神经系统的发育分化，调控神经系统中靶标基因的选择性剪接；而RBP9和FNE研究较少，且二者在神经系统中的功能尚未明确。本文将以FNE和RBP9为研究对象，探究两者的互作蛋白，初步揭示二者在果蝇生长发育中的分子生物学功能。主要研究内容和结果如下： 前期本课题组利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，分别在rbp9和fne基因前敲入3×Flag和V5融合蛋白标签序列，成功获得V5-FNE和3×Flag-RBP9转基因果蝇品系。同时利用果蝇遗传杂交实验，构建了V5FNE-3×FlagRBP9果蝇品系。首先，以这三个果蝇品系的头部为实验材料，利用免疫沉淀技术检测到RBP9与FNE在蛋白质水平上存在相互作用，这与之前利用果蝇杂交实验检测到的二者互作相一致，表明RBP9与FNE的相互作用在果蝇生长发育中具有重要的意义。 其次，通过pull down实验方法纯化富集RBP9，对纯化产物进行质谱检测，鉴定与RBP9互作的蛋白。经分析，鉴定得到190个特异与RBP9可能存有相互作用的蛋白质。经GO分析，发现这些蛋白质主要参与了核小体、染色质组装、线粒体合成等生物学过程；KEGG富集分析显示，这些互作蛋白主要参与碳代谢、核糖体、柠檬酸循环（TCA循环）和氨基酸的生物合成等通路。由此推测RBP9通过与这些蛋白质相互作用，在基因转录、转录后调控、翻译等过程起着重要的调控作用。 最后，以果蝇中FNE氨基酸序列在NCBI中进行BLAST，在家蚕数据库中找到2个同源基因，分别为Bmel-1和Bmel-2，其编码的蛋白质均含有3个RRMs。利用RT-PCR检测2个基因在家蚕品系p50不同组织不同时期表达谱，结果显示Bmel-1和Bmel-2在五龄第3天的头部、精巢和卵巢中表达水平较高；二者在胚胎期表达相似，呈现不断上升的趋势，在胚胎后期达到最高值；在蚁蚕到四龄眠的幼虫期，Bmel-1表达水平较平稳，在四龄起表达量减弱，Bmel-2呈现明显的下降趋势；在蛹期和成虫阶段，Bmel-2表达量较低，Bmel-1在雌、雄蛹和成虫均有较稳定表达水平。研究结果为后续解析ELAV蛋白家族在家蚕生长发育等过程中的生物学功能奠定基础。

目录

声明

缩略表

第1章 绪论

1.1 RNA结合蛋白

1.2 ELAV/ Hu RNA结合蛋白家族

1.2.1哺乳动物中ELAV/Hu蛋白家族

1.2.2果蝇中ELAV / Hu RNA结合蛋白家族

1.2.3 ELAV/Hu蛋白家族与疾病

1.3家蚕中含有RRM结构域的RNA结合蛋白

1.4 本文研究内容

第2章 果蝇神经系统中FNE与RBP9相互作用的研究

2.1 引言

2.2 实验材料与试剂

2.2.1 实验材料

2.2.2 常用试剂和缓冲液的配置

2.2.3 主要实验仪器和设备

2.2.4 生物信息学分析网站

2.3实验方法

2.3.1 CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建V5-FNE和3×Flag-RBP9果蝇品系

2.3.2 构建V5FNE-3×FlagRBP9果蝇品系

2.3.3 果蝇基因组的提取

2.3.4 常规PCR反应

2.3.5 果蝇头部组织蛋白提取

2.3.6 目的蛋白免疫共沉淀

2.3.7 SDS-PAGE电泳及Western Blot检测

2.4 结果与分析

2.4.1 获得3×Flag-RBP9转基因果蝇品系

2.4.2 获得V5FNE-3xFlagRBP9纯合果蝇品系

2.4.3 FNE与RBP9在蛋白质水平上存在直接相互作用

2.5 讨论

2.5.1 构建转基因果蝇品系

2.5.2 构建V5FNE-3×FlagRBP9果蝇品系

2.5.3 FNE和RBP9相互作用的研究

2.6 本章小结

第3章 RBP9互作蛋白的研究

3.1 引言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 果蝇品种

3.2.2 实验试剂

3.2.3 常用试剂和缓冲液的配置

3.2.4生物信息学分析软件

3.2.5 实验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 果蝇神经系统RBP9纯化检测

3.3.2质谱检测分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

第4章家蚕中ELAV-like RNA结合蛋白家族表达谱的研究

4.1 引言

4.2 实验材料与设备

4.2.1 实验材料

4.2.2 生物信息学分析软件

4.2.3 主要实验仪器和设备

4.3 实验方法

4.3.1常用PCR和qRT-PCR体系及程序

4.3.2 RNA提取

4.3.3 反转录

4.4 结果与分析

4.4.1 家蚕Bmelav-like基因

4.4.2 Bmel-1、Bmel-2基因组织和时期表达谱分析

4.5 讨论

4.5.1 Bmel-1，Bmel-2在家蚕不同组织中的表达情况

4.5.2 Bmel-1，Bmel-2在家蚕不同时期的表达情况

4.6 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢