家蚕含保幼激素结合蛋白结构域的BmJHBP基因家族鉴定及BmJHBPd2的功能研究

摘要

家蚕（Bombyx mori）是由古代野桑蚕经长期驯化而成的泌丝昆虫，在生物学领域是经典的模式生物，在经济上具有极高的价值。由咽侧体合成的保幼激素（Juvenile hormone，JH）与前胸腺合成的蜕皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）是调控家蚕生长发育以及变态的两种重要激素。其中，JH经过咽侧体合成并分泌至血淋巴中，与保幼激素结合蛋白（Juvenile hormone binding protein，JHBP）结合并被运送到不同的靶器官，进而调控家蚕的生长发育。家蚕的经济效益与合成蚕丝蛋白的发达丝腺密不可分。早有研究报道，对家蚕添食JH能够增加丝蛋白的产量，而家蚕JHBP（BmJHBP）作为JH信号通路传导的第一个关键分子，与丝蛋白合成的关系是不清楚的。此前，学者已经鉴定了家蚕部分的BmJHBP基因，发现在家蚕的多个组织器官内均有表达，其主要表达在脂肪体和中肠。本研究旨在运用生物信息学全面鉴定并分析家蚕JHBP基因家族成员，采用RT-PCR、克隆、Western blot、免疫荧光等技术手段对家蚕后部丝腺特异高量表达的BmJHBP基因的表达模式以及功能进行了分析和研究。
　　本研究主要内容包括：⑴基于家蚕基因组数据库和NCBI，首先利用生物信息学对家蚕BmJHBP基因家族成员进行了鉴定。结果显示，总共鉴定到了41个BmJHBP基因，分别分布在8条染色体上，主要位于第15和23号染色体。基因结构分析发现，家族JHBP基因结构呈现出多样化，在基因长度、外显子等方面均有较大差异。信号肽预测发现，33个 BmJHBP基因编码一个信号肽，8个BmJHBP基因不编码信号肽。经过蛋白质结构域分析，家蚕BmJHBP蛋白至少含有1个 JHBP结构域，且发现部分 BmJHBP蛋白同时包含 JHBP和Grp7_allergen结构域。将家蚕BmJHBP与小菜蛾PxJHBP、果蝇DmJHBP、蜜蜂AmJHBP等物种进化分析，结果表明JHBP基因家族可以分为两枝、四个亚家族。芯片数据和RT-PCR实验均表明，BmJHBP主要表达于生殖腺、头、表皮、中肠。RT-PCR分析发现，BmJHBPd2是整个家蚕JHBP基因家族中唯一在后部丝腺高量表达基因。⑵利用生物信息学分析BmJHBPd2基因，结果表明该基因全长为8053bp，包括5个外显子和4个内含子，开放阅读框（Open reading frame，ORF）长度为732bp，编码243个氨基酸，前18个氨基酸编码一个信号肽，剩下的氨基酸编码一个典型的 JHBP结构域，等电点为4.80，预测分子量大小为27.3kD，位于23号染色体的nscaf3027区域内。在蛋白水平上，利用Western blot方法检测BmJHBPd2蛋白在大造5龄第3天各组织的表达情况，发现BmJHBPd2高量表达于后部丝腺，这与芯片数据和RT-PCR结果一致。然后，通过RT-PCR分析BmJHBPd2在大造4龄第3天到蛹期的时期表达情况，发现BmJHBPd2在5龄1天到5天高量表达，在4龄眠期和5龄末期表达量较低。为了进一步验证BmJHBPd2蛋白在细胞的表达部位，构建了pSLfa1180-GFP-BmJHBPd2细胞过表达载体，转染至BmE细胞，采用免疫荧光实验，结果表明BmJHBPd2表达于BmE细胞的细胞质中。利用石蜡切片和免疫荧光等方法，对BmJHBPd2在家蚕后部丝腺组织的表达部位作了定位分析，发现该蛋白在后部丝腺的细胞质层中高量表达，这与前面的RT-PCR、Western blot、亚细胞定位结果相一致。最后，qRT-PCR分析了BmJHBPd2在低产丝量品种大造和高丝量品种872的表达量差异，结构表明在5龄第3天和5龄第5天，BmJHBPd2在872的表达量明显高于大造，暗示这可能与丝蛋白合成有关系。通过GC-MS技术对家蚕5龄第3天后部丝腺的JH做了定性检测，质谱结果表明，与标准品相比，在后部丝腺的同一时间检测到JH峰，说明家蚕在5龄第3天的后部丝腺具有JH。⑶选取大造5龄第1天家蚕，沿背中线涂抹1ug的JHA。结果表明，经JHA涂抹的家蚕，其上蔟及化蛹时间均出现延迟1～2天。另外，涂抹JHA之后，家蚕的经济性状均明显提高。选取涂抹JHA后的12h、24h、48、72h家蚕，经过 qRT-PCR检测 BmJHBPd2的表达水平，发现家蚕在涂抹 JHA后的BmJHBPd2的表达量呈现上调的趋势，说明外源JHA能够促进BmJHBPd2的表达。为了进一步研究BmJHBPd2的功能，构建了pSLfa1180-BmJHBPd2细胞过表达载体，转染至BmE细胞，qRT-PCR实验表明向培养基添加JHA之后，JH信号通路上的早期因子Kr-h1显著上调表达，说明JHA激活JH信号通路。单独过表达BmJHBPd2，JH信号通路上的相关基因表达量没有明显变化，说明单独过表达BmJHBPd2不能激活JH信号通路，对fib-H的表达也没影响。过表达BmJHBPd2并添加JHA与单独添加JHA相比，前者的JH信号通路上的基因比起后者呈现出下调表达的趋势，说明BmJHBPd2的过表达能够抑制JH通路信号的传递。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1昆虫JH的研究

1.2 保幼激素结合蛋白的研究进展

1.3 昆虫JH的作用机制

1.4 家蚕丝腺及丝蛋白调控的研究进展

第二章 引言

2.1 研究背景及目的意义

2.2 研究内容

2.3 技术路线

第三章 家蚕JHBP基因家族鉴定及分析

3.1 实验材料与试剂

3.2 实验方法与步骤

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四章 家蚕BmJHBPd2的表达模式分析及后部丝腺JH的鉴定

4.1 实验材料与试剂

4.2 实验方法与步骤

4.3 实验结果

4.4讨论

第五章 家蚕BmJHBPd2蛋白与JH关系的研究

5.1 实验材料与试剂

5.2 实验方法与步骤

5.3 实验结果

5.4 讨论

第六章 综合与讨论

参考文献

参研课题情况与发表文章

致谢