家蚕山梨醇脱氢酶基因与蜕皮激素合成途径基因Shadow的功能研究

摘要

家蚕（Bombyx mori）是重要的经济昆虫和鳞翅目模式生物。滞育和变态发育是家蚕重要的特性，其分子机制的研究一直是蚕业科学领域的难点和热点，迄今仍未完全阐明。家蚕是典型的卵滞育昆虫，根据其在自然条件下1年发生的世代数可分为一化性、二化性和多化性，根据幼虫期眠或蜕皮的次数又可分为三眠蚕、四眠蚕和五眠蚕。为深入了解家蚕山梨醇脱氢酶基因BmSDH的特性、蜕皮激素合成途径(Ecdysteroidogenic Pathway,EP)Shadow基因在滞育和变态发育中的作用，本文以家蚕二化性品种秋丰为材料，利用5'RACE、qRT-PCR和CRISPR/Cas9等技术，研究BmSDH与Shadow基因的功能，取得以下主要结果。 1.家蚕山梨醇脱氢酶基因的转录起始位点确定及启动子结构分析。用5'RACE技术确定BmSDH基因的转录起始位点；利用NNPP、JASPAR、Alibaba2.1等在线软件对转录起始位点上游2kb及下游200bp序列进行分析。结果表明，BmSDH-1的转录起始位点为A（-41），BmSDH-2a的转录起始位点为C（-41），BmSDH-2b的转录起始位点为A（-40）（翻译起始位点为+1）；预测到核心启动子区和转录因子结合位点多集中在近1kb序列区；在这3个基因转录起始位点上游25-30bp处均未找到TATA框，其与典型的真核生物启动子序列结构不同。 2.家蚕山梨醇脱氢酶基因启动子特性及不同激素对BmSDH-2a的调控分析。分别克隆BmSDH-1，-2a，-2b基因约1kb及BmSDH-2a不同片段的启动子区序列，构建带有萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-BmSDH-P-luc，与pRL-CMV报告质粒（含海肾荧光素酶报告基因）共转染家蚕BmN细胞，分别在培养基中添加昆虫保幼激素、蜕皮激素以及滞育激素；通过双荧光素酶报告系统检测BmSDH启动子活性以及不同激素处理对BmSDH-2a基因启动子活性的影响。结果显示，BmSDH-2a启动子活性极显著高于BmSDH-1和BmSDH-2b启动子；BmSDH-2a355bp长度片段的启动子转录活性极显著高于674bp和1117bp长度片段。用滞育激素处理时，BmSDH-2a1117bp启动子活性随着激素浓度的升高有上升的趋势，当浓度高于100ng/mL时启动子活性有所降低但仍保持在较高水平；用保幼激素进行处理时，随着激素浓度的升高启动子活性逐渐降低；蜕皮激素处理时，100pg/mL激素显著增强启动子活性，当激素浓度继续升高时启动子活性逐渐降低。 3.蜕皮激素合成途径基因在二化性家蚕蛹初期的表达特性分析。已有研究显示蜕皮激素参与家蚕胚胎滞育的调节，但其分子机制尚未清晰。为探索蜕皮激素合成通路基因在家蚕滞育过程中的作用，以二化性家蚕秋丰为材料，依据二化性家蚕子代卵滞育性受亲代催青环境调控的特点，通过控制催青条件分别建立滞育诱导组(diapause eggs producers,DEPs)和非滞育诱导组(non-diapause eggs producers,NDEPs)。在蛹期分析蜕皮激素通路基因在两组间的表达差异。结果显示：Neverland、Spook和Cyp18a1在DEPs组上调表达，Phanton和Shade基因在两组间的表达水平无显著差异，Disembodied和Shadow基因则在NDEPs组上调表达。在NDEPs蛹期第3天卵巢组织中，Shadow的表达显著增加并达到峰值，由于此时期滞育激素也大量分泌，推测Shadow与滞育高度相关。为了验证这一假设，在NDEPs蛹期第2天对Shadow基因进行RNA干涉，48h后检测到Shadow的表达水平显著下降；蜕皮激素通路下游基因βFtz-F1表达水平显著降低；编码犬尿氨酸合成酶基因在卵巢组织中的表达显著上调；与Shadow，犬尿氨酸合成酶基因均存在关联的Brown，AdenoK在脂肪体中显著上调表达。产卵后48h，经dsShadow干涉的子代卵部分呈现浅紫色，表现出一定滞育倾向。上述结果表明对Shadow抑制可上调3-羟犬尿氨酸合成酶基因的表达。此外，克隆了Shadow基因的ORF并成功在E.coil中表达，为进一步研究Shadow蛋白的功能建立基础。 4.基于CRISPR/Cas9技术的Shadow基因功能研究。联合CRISPR/Cas9基因编辑系统和显微注射技术对Shadow基因进行敲除，以进一步研究家蚕Shadow基因的功能。首先在BmN细胞中筛选具切割活性的gRNA靶位点，对NDEPs产下的非滞育卵显微注射gRNA与Cas9混合物，待孵化后对蚕蛾进行编号，常规饲养至交配产下G1代，对G0代个体提取基因组检测突变情况。结果在G0代检测到1头嵌合体，G2代筛选出突变纯合体，该突变纯合体1龄期发育正常，能按时就眠；2龄将眠初期蚕体有光泽，但进食量少，维持该阶段6-8日，仍然不蜕皮，不能正常进入3龄期，最后能量耗尽陆续死亡。该突变体检测结果显示在第3外显子上缺失42个碱基，对其转录水平进行分析，发现Shadow在mRNA水平上的表达极显著低于对照组，推测由于突变体内Shadow基因的低表达导致突变体2龄不眠。对突变家蚕添食20-E，发现添食20-E后突变体蚕顺利进入3龄，说明家蚕体内20-E合成不足是出现2龄不眠蚕的主要原因。实验表明Shadow基因是家蚕蜕皮激素合成途径中的重要基因。 通过上述分析，我们确定了家蚕BmSDH-1,-2a，-2b基因的转录起始位点，BmSDH-2a的表达受蜕皮激素影响；在家蚕NDEPs组蛹期第3天发现存在蜕皮激素的积累，对Shadow基因干涉能上调家蚕犬尿氨酸合成途径，推测BmShadow基因参与家蚕滞育过程的调节；最后成功利用CRISPR/Cas9系统在家蚕“秋丰”品种中敲除BmShadow基因，并筛选出突变纯合体；为进一步阐述家蚕的滞育准备期调控机制提供了实验基础。

目录

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英文缩写说明

第1章 绪 论

1.1 昆虫滞育

1.1.1滞育的概念

1.1.2 滞育的阶段

1.2 家蚕滞育的遗传学基础

1.3 滞育激素的研究

1.3.1 滞育激素与碳水化合物代谢

1.3.2 滞育激素与色素代谢

1.4 昆虫蜕皮激素的研究

1.4.1 蜕皮激素合成途径

1.4.2 细胞色素P450的研究

1.4.3 蜕皮激素信号转导

1.5 基因编辑研究进展

1.5.1 基因组编辑技术概述

1.5.2 CRISPR 的结构与分类

1.5.3 CRISPR/Cas9 的作用机理

1.6 研究目的与研究意义

1.7 主要研究内容

（1）家蚕山梨醇脱氢酶基因转录起始位点的确定 及启动子序列分析

（2）家蚕山梨醇脱氢酶基因特性及激素在体外对 BmSDH-2a基因的调控作用分析

（3）蜕皮激素合成通路基因在二化性家蚕蛹初期的 表达特性分析

（4）家蚕 Bm Shadow 基因功能研究

1.8 技术路线

第2章 家蚕山梨醇脱氢酶基因转录起始位点确定及其启动子结构分析

2.1 引言

2.2材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 实验仪器

2.2.3 实验试剂

2.2.4 实验方法

2.3 结果与分析

2.2.1 总RNA质量检验

2.2.2 BmSDH转录起始位点的确定

2.2.3 BmSDH系统进化分析

2.2.4 BmSDH-1，-2a，-2b启动子的结构特点

2.4 讨论

2.5 本章小结

第3章 家蚕山梨醇脱氢酶基因BmSDH-1，-2a，-2b的启动子特性以及激素体外对BmSDH-2a的调控分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.2 实验仪器

3.2.3 实验试剂

3.2.4 实验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 BmSDH基因启动子转录活性分析

3.3.2 BmSDH-2a不同长度启动子片段的转录活性分析

3.3.3不同激素处理对BmSDH-2a启动子活性的影响

3.4讨论

3.5 本章小结

第4章 蜕皮激素合成通路基因在二化性家蚕蛹初期的表达特性分析

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 实验材料

4.2.3 实验试剂

4.2.4 实验方法

4.3 结果与分析

4.3.1 20-E合成途径基因在DEP和NDEP蛹期卵巢组织的差异表达

4.3.2 Shadow在DEP和NDEP组蛹期各组织的表达

4.3.3 dsRNA干涉后犬尿氨酸合成酶基因及相关基因表达

4.3.4 Shadow干涉对子代卵的犬尿氨酸合成影响

4.3.5 Shadow的克隆与分析

4.3.6Shadow在E.coil中的表达及Western blot检测

4.4讨论

4.4 本章小结

第5章 基于CRISPR/Cas9技术的家蚕Shadow基因功能研究

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 实验材料

5.2.2 实验仪器

5.2.3实验试剂

5.3 结果与分析

5.3.1 BmShadow进化分析

5.3.2 CRISPR/Cas9靶点设计

5.3.3 sgRNA在细胞中的活性检测

5.3.4 CRISPR/Cas9在G0代敲除检测

5.3.5 Shadow突变体筛选

5.3.6 G3代突变体添食20-E

5.4 讨论

5.5 本章小结

结论

创新点

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢