降解养殖水体亚硝酸盐的微生物制剂研究

摘要

我国是个渔业大国，近年来淡水养殖规模日益扩大，集约化、高密度养殖已成为当前水产养殖业的主流模式。而随之出现的养殖水体水质恶化、水产养殖动物疾病多发的问题制约了养殖经济效益的进一步提高，其中亚硝酸盐含量超标的问题尤为突出。亚硝酸盐是氨在转化为硝酸盐过程中的中间产物，含量超标会对鱼体产生毒害作用，严重的会使养殖动物大量死亡，对水产养殖业造成极大的危害。因此它的含量是评价养殖水体水质的最要指标之一。
　　 本论文通过对NO2-降解菌株的筛选、菌株培养条件的优化、复合微生物制剂的制备以及养殖水体环境对NO2-降解率的影响等方面进行了研究，初步探索了该复合微生物制剂应用于降解养殖水体NO2-的可行性。主要研究结果如下：
　　 1.从虾塘淤泥中分离出一株光合细菌，初步鉴定为球形红假单胞菌。
　　 2.分别对分离得到的光合细菌Ⅰ以及实验室保藏菌株植物乳杆菌、短乳杆菌、热带假丝酵母进行了降解液体培养基中NO2-的试验研究。结果表明，该四株菌株对液体培养基中的NO2-均有很好的降解效果。在接种后第2d，光合细菌Ⅰ、植物乳杆菌、短乳杆菌、热带假丝酵母的NO2-降解率分别为47.06％、98.1％、95.62％、95.51％;在培养的10d内NO2-的最高降解率分别为99.96％、99.96％、99.94％、99.97％。
　　 3.对选取的四株菌株进行降解养殖水样NO2-的试验研究。研究结果表明，光合细菌Ⅰ、植物乳杆菌、短乳杆菌、热带假丝酵母在培养过程中对养殖水样中NO2-的最高降解率分别为85.87％、92.19％、81.25％、92.52％。其中，短乳杆菌在培养的第12d有大幅度的反弹现象：光合细菌Ⅰ、植物乳杆菌、热带假丝酵母在被测的10d内效果比较稳定。因此，选定光合细菌Ⅰ、植物乳杆菌、热带假丝酵母为试验菌株，制备降解养殖水体NO2-的复合微生物制剂。
　　 4.对试验菌株的培养条件进行了优化。采用正交试验得到植物乳杆菌高密度培养的最佳培养条件：总糖度7％的麦芽汁、2％水解植物蛋白粉、发酵温度35℃、pH8、接种量7％，在此条件下培养21h，培养液中的活菌数可以达到2.9×109cfu/mL;通过均匀设计试验得到热带假丝酵母的最佳培养条件：总糖度4％的麦芽汁、pH5、温度26℃、装液量25mL、接种量2％、转速100rpm，在此条件下培养36h，培养液OD560值达到2.79;采用响应面分析设计方法对光合细菌Ⅰ的培养条件进行优化，优化后的光合细菌Ⅰ培养条件为：NH4C10.99g、NaHCO31.68g、酵母膏0.6g、乙酸钠2.5g、K2HPO40.4g、FeSO40.005g、MgCl20.4g、NaC12g、温度30℃、pH8、接种量8.9％、光照3500Lx、蒸馏水1000mL，在此条件下培养5d，培养液OD660可从0.972提高到1.343。
　　 5.采用正交试验确定了复合微生物制剂中菌株间的最佳配比。试验结果表明，复合微生物制剂降解NO2-的最优配比为光合细菌Ⅰ：植物乳杆菌：热带假丝酵母=1:2：1(v/v/v)，以此配比组合的微生物制剂对养殖水样NO2-的降解率为97.5％。
　　 6.分别在25℃和4℃两种条件下贮藏，按0.5％的接种量接种，对该复合微生物制剂的贮藏活性进行了研究。研究结果表明，25℃条件下贮藏的发酵液存放30d时，接种培养48hN02-的降解率可达93.5％，基本没有降低，而存放60d时，接种培养48h NO2-的降解率仅为8.63％，其原因是微生物死亡率较高；而4℃贮藏的发酵液在存放90d时，接种培养48h NO2-的降解率仍可高达98.27％，说明低温贮藏条件下，复合微生物制剂降解NO2-的性能保持良好。因此，该复合微生物制剂4℃条件下贮藏期至少为90d，25℃条件下贮藏期为30d。
　　 7.探讨了复合微生物制剂的生物量与降解NO2-能力的关系，结果表明在养殖水样中菌体生长与降解NO2-作用是同步关系。此外，对复合微生物制剂降解养殖水体NO2-的特性进行了研究表明，养殖水体生态因子如初始NO2-浓度、pH值、温度、溶氧以及接种量对微生物制剂降解NO2-都有影响。其中，初始NO2-浓度对复合微生物制剂降解NO2-的能力影响显著，当NO2-浓度在5mg/L以下时，其NO2-降解率均在95％以上，当NO2-浓度高于5mg/L时，对NO2-的降解率下降；pH的影响作用最小；较适合的培养条件为温度35℃、接种量0.5％、静置培养。复合微生物制剂在此条件下培养24h，NO2-降解率可达99.31％。
　　 8.对复合微生物制剂降解NO2-的机制进行了初步探索。在NO2-被降解完全时，培养液中检测不到氨态氮和硝酸盐的产生，用顶空固相微萃取方法抽取密封瓶培养液上空气体，用GC/MS对气体的组成进行检测，推测NO2-的降解途径为NO2--N→N2。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1.1 养殖水体中亚硝酸盐的污染与危害

1.1.1 养殖水体中氮素的循环过程

1.1.2 养殖水体中亚硝酸盐的污染

1.1.3 亚硝酸盐对养殖动物的危害

1.2 养殖水体中亚硝酸盐的稳定性及降解机理

1.2.1 影响养殖水体中亚硝酸盐积累的主要因素

1.2.2 养殖水体中亚硝酸盐的降解机理

1.3 降解养殖水体中亚硝酸盐的方法

1.3.1 传统方法及存在问题

1.3.2 微生物方法

1.4 国内外关于微生物法降解养殖水体中亚硝酸盐的研究进展

1.5 复合微生物制剂的研究及存在问题

1.6 立题依据与主要研究内容

第二章 养殖水体NO2-降解菌的筛选

2.1 引言

2.2 试验材料与仪器设备

2.2.1 水样

2.2.2 菌种来源

2.2.3 培养基

2.2.4 试验仪器与设备

2.3 试验方法

2.3.1 光合细菌的富集培养

2.3.2 光合细菌的分离纯化

2.3.3 菌种鉴定方法

2.3.4 NO2-标准曲线的绘制

2.3.5 菌种活化培养方法

2.3.6 发酵液的制备

2.3.7 水质测定指标及方法

2.3.8 NO2-降解率的计算

2.3.9 光合细菌Ⅰ降解液体培养基中NO2-的试验

2.3.10 光合细菌Ⅰ降解养殖水样NO2-的试验

2.3.11 乳酸菌降解液体培养基中NO2-的试验

2.3.12 乳酸菌降解养殖水样NO2-的试验

2.3.13 热带假丝酵母降解液体培养基中NO2-的试验

2.3.14 热带假丝酵母降解养殖水样NO2-的试验

2.4 结果与讨论

2.4.1 光合细菌Ⅰ的分离及初步鉴定

2.4.2 NO2-标准曲线的绘制

2.4.3 光合细菌Ⅰ降解液体培养基中NO2-的试验

2.4.4 光合细菌Ⅰ降解养殖水样NO2-的试验

2.4.5 乳酸菌降解液体培养基中NO2-的试验

2.4.6 乳酸菌降解养殖水样NO2-的试验

2.4.7 热带假丝酵母降解液体培养基中NO2-的试验

2.4.8 热带假丝酵母降解养殖水样NO2-的试验

2.5 小结

第三章 养殖水体NO2-降解菌培养条件的优化

3.1 引言

3.2 试验材料与仪器设备

3.2.1 水样

3.2.2 菌种

3.2.3 培养基

3.2.4 试验材料

3.2.5 试验设备

3.3 试验方法

3.3.1 麦芽汁的制备

3.3.2 菌种活化方法

3.3.3 发酵液的制备

3.3.4 活菌数的测定

3.3.5 培养条件的优化

3.3.6 生长曲线的绘制

3.4 结果与讨论

3.4.1 植物乳杆菌培养条件的优化

3.4.2 植物乳杆菌生长曲线的测定

3.4.3 热带假丝酵母培养条件的优化

3.4.4 热带假丝酵母生长曲线的测定

3.4.5 光合细菌Ⅰ培养条件的优化

3.4.6 光合细菌Ⅰ生长曲线的测定

3.5 小结

第四章 复合微生物制剂的制备及贮藏活性

4.1 引言

4.2 试验材料与仪器设备

4.2.1 水样

4.2.2 菌种

4.2.3 培养基

4.2.4 试验仪器与设备

4.3 试验方法

4.3.1 菌种活化方法

4.3.2 发酵液的制备

4.3.3 水质测定指标及方法

4.3.4 NO2-降解率的计算

4.3.5 复合微生物制剂的制备

4.3.6 贮藏时间对复合微生物制剂降解养殖水样NO2-能力的影响

4.4 结果与讨论

4.4.1 复合微生物制剂的制备

4.4.2 贮藏时间对复合微生物制剂降解养殖水样NO2-能力的影响

4.5 小结

第五章 养殖生态因子对NO2-降解率的影响

5.1 引言

5.2 试验材料与仪器设备

5.2.1 水样

5.2.2 菌种

5.2.3 培养基

5.2.4 试验仪器与设备

5.3 方法

5.3.1 菌种活化方法

5.3.2 发酵液的制备

5.3.3 复合微生物制剂的制备

5.3.4 水质指标及测定方法

5.3.5 NO2-降解率的计算

5.3.6 菌体生长量的测定

5.3.7 菌株细胞生长与降解养殖水样NO2-能力的关系

5.3.8 养殖生态因子对复合微生物制剂降解养殖水样NO2-能力的影响

5.4 结果与分析

5.4.1 菌株细胞生长与降解养殖水样NO2-能力的关系

5.4.2 养殖生态因子对复合微生物制剂降解养殖水样NO2-能力的影响

5.5 小结

第六章 复合微生物制剂降解NO2-作用机制的初探

6.1 引言

6.2 试验材料与仪器设备

6.2.1 水样

6.2.2 菌种

6.2.3 培养基

6.2.4 试验仪器与设备

6.3 试验方法

6.3.1 菌种活化方法

6.3.2 发酵液的制备

6.3.3 复合微生物制剂的制备

6.3.4 复合微生物制剂降解养殖水样NO2-机制的初步探索

6.4 结果与讨论

6.4.1 氨态氮的检测

6.4.2 硝酸盐的检测

6.4.3 含氮气体的检测

6.5 小结

第七章 结论与展望

7.1 主要结论

7.2 工作展望

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文