环氧合酶-2抑制剂预防乳腺癌细胞多药耐药发生的研究

摘要

目的：1．应用化疗药物阿霉素(doxorubicin，Doxo)诱导乳腺癌细胞株MCF-7获得性多药耐药发生，以此耐药诱导模型为基础将选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布(celecoxib)与耐药诱导剂量的阿霉素联合作用于MCF-7细胞，检测耐药相关基因及蛋白的变化，探讨塞来昔布对阿霉素诱导MCF-7细胞多药耐药发生的预防作用。2．联合应用塞来昔布及阿霉素，探讨塞来昔布对阿霉素细胞毒效应的增敏作用。3．从MDR1基因转录调控入手，检测相关转录因子在基因、蛋白水平的变化及其与DNA的结合活性，探讨塞来昔布下调阿霉素诱导MDR1过表达的机制。 方法：1．四唑蓝(MTT)比色法：检测不同浓度阿霉素对MCF-7细胞的生长抑制效应，寻找适宜的阿霉素浓度及作用时间进行耐药诱导；联合应用阿霉素及低浓度的塞来昔布(无明显细胞生长抑制效应)，计算阿霉素对MCF-7细胞的半数抑制浓度(IC50)，分析塞来昔布对阿霉素细胞毒效应的增敏作用。2．逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)检测MDR1、MRP1、topoⅡ、GST、NF．KB、c—Jun及YB-1等基因的mRNA表达水平。3．流式细胞术(flowcytometry，FCM)检测细胞膜P—糖蛋白(P—gp)表达水平。4．细胞内罗丹明123(Rh0123)潴留实验分析P—gp的功能状态。5．免疫印迹反应(Westernblot法)检测MRP1、NF—κB、c—iun及YB-1蛋白表达水平。6．凝胶迁移滞后实验(EMSA)方法检测转录因子NF—κB及AP-1与DNA的结合活性。7．FCM检测阿霉素、塞来昔布单独作用及联合应用对MCF-7细胞周期的影响。 结果：1．MTT结果显示：阿霉素0.05ug/ml作用于MCF-7细胞，3d后生长受抑制，7d后生长抑制效应明显减弱，生长抑制率分别为23.70％及9.03％；但在0.5ug/ml的浓度作用下，3d后生长抑制效应明显，7d后抑制效应进一步增强，生长抑制率分别为60％及72.90％；此表明，阿霉素0.05ug/ml作用7d，可诱导MCF-7细胞耐药发生。2．阿霉素0.05ug/ml处理MCF-7细胞7d与末处理组相比：RT—PCR发现MDR1及MRP1在mRNA水平上调(P＜0.01)；TopoⅡ及GST在mRNA水平差异性不显著(P＞0.05)；Western—blot发现MRP1蛋白表达与其mRNA表达水平相一致；FCM显示细胞膜P—gp表达上调，荧光强度为32.66±2.49，而未处理组为4.67_+0.49(P＜0.01)。3．与阿霉素0.05ug/ml组相比，阿霉素0.05ug/ml联合塞来昔布(10uM，20uM)处理7d，MDR1、MRP1在mRNA水平下调(P＜0.01)；其蛋白表达与mRNA表达变化相一致；细胞膜P—gp荧光强度分别为6.41±0.71及5.55±0.50，而阿霉素0.05ug/ml组为32.66±2.49，差异性显著(P＜0.01)。4．阿霉素0.05ug/ml联合塞来昔布(10uM，20uM)处理7d，细胞内Rh123的荧光强度明显增加，分别为373.03±15.41及341.44±11.75，与阿霉素单用组72.77±8.88相比，差异性显著(P＜0.0105．阿霉素0.05ug/ml组与未处理组相比，转录因子YB-1、NF—κB和c—Jun在mRNA及蛋白水平均上调；阿霉素0.05ug/ml联合塞来昔布10uM组与阿霉素0.05ug/ml组相比，YB-1、NF—κB和c—Jun在mRNA及蛋白水平均下调。6．阿霉素0.05ug/ml组与未处理组相比，转录因子NF—κB和AP-1的活性明显增高；阿霉素0.05ug/ml联合塞来昔布10uM组与阿霉素0.05ug/ml组相比，NF—κB和AP-1的活性均明显降低。7．阿霉素联合塞来昔布10uM作用48h后，可显著抑制MCF-7细胞的生长，IC50为(0.38±0.04)ug/ml，而阿霉素单用的IC50为(0.67±0.03)ug/ml(P＜0.01)。8．与未处理组相比，阿霉素0.05ug/ml组及阿霉素0.05ug/ml联合塞来昔布10uM组，G0+G1期细胞比率均增加(P＜0.01)，S期细胞比率均减少(P＜0.01)；塞来昔布10uM单独作用组G0+G1期及S期细胞比率无显著差异性(P＜0.05)；与阿霉素0.05ug/ml组相比，阿霉素0.05ug/ml联合塞来昔布10uM组G0+G1期细胞比率增加(P＜0.01)，S期细胞比率减少(P＜0.01)；G2+M期细胞比率在各组间均无显著差异(P＞0.05)。 结论：1．阿霉素0.05ug/ml作用于MCF-7细胞7d可成功诱导多药耐药发生，细胞内MDR1、MRP1在mRNA及蛋白水平均上调。2．在MCF-7细胞中，塞来昔布可有效干预阿霉素诱导的MDR1、MRP1过表达，预防多药耐药的发生。3．塞来昔布下调MDR1基因表达与抑制转录因子YB-1、NF—κB和AP-1的表达及活性相关。4．塞来昔布对阿霉素的细胞毒效应有明显的增敏作用，可将MCF-7细胞阻滞于G0+G1期。 综上所述，环氧合酶-2抑制剂塞来昔布可通过多种机制预防乳腺癌细胞多药耐药的发生，为临床肿瘤治疗提供新的策略。

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声明

第一章绪 论

1.1肿瘤多药耐药概述

1.2多药耐药的机制

1.2.1膜外排泵介导的耐药机制

1.2.2酶介导的耐药机制

1.2.3.凋亡介导的耐药机制

1.3 P-gp的表达调控

1.3.1 NF-κB与MDR1基因

1.3.2 YB-1与MDR1基因

1.3.3 AP-1与MDR1基因

1.4肿瘤多药耐药预防策略进展

1.4.1针对药物外排机制的耐药预防研究

1.4.2嵌段共聚物

1.4.3蛋白激酶C抑制剂用于耐药预防

1.4.4其他

1.5环氧合酶-2及其抑制剂与肿瘤多药耐药

1.5.1 COX-2的结构和功能

1.5.2 COX-2与肿瘤多药耐药的相关性

1.5.3 COX-2通过外排泵参与多药耐药

1.5.4 COX-2通过凋亡途径参与多药耐药

1.6本课题的着眼点和主要的研究思路

第二章环氧合酶-2抑制剂预防乳腺癌细胞多药耐药发生的研究

2.1 材料

2.1.1主要试剂

2.1.2主要仪器

2.1.3细胞株

2.2 方法

2.3结果

2.4.讨论

第三章主要结论和展望

3.1 主要结论

3.2 展望

参考文献

论文发表附录

致 谢