7-氮杂异靛蓝衍生物体内外抗肿瘤作用及诱导肿瘤细胞死亡机理研究

摘要

本实验的研究目的是从新合成的一系列7-氮杂靛玉红类衍生物中筛选出能够有效抑制肿瘤细胞增殖的化合物，探讨其可能的作用机制，为研发具有自主知识产权的靛玉红类抗肿瘤新药打下基础。
　　 MTT法从9种化合物中筛选出4种溶解性较好的化合物。4种化合物以不同浓度作用于HepG2，Hela，A549，Eca109四种肿瘤细胞株48 h，MTT法检测化合物对肿瘤细胞增殖的影响，计算其IC50值；选取6号化合物(7-AI-b)进行抗肿瘤机制研究。活细胞工作站观察细胞形态的变化；Hoechst33342染色观察细胞核的变化；Annexin-V/PI双染检测细胞凋亡率；Western印记检测细胞色素C(Cyto C)的转位和caspase-3蛋白的活化；DCFH-DA染色检测活性氧(ROS)生成；JC-1染色检测线粒体膜电位；荧光素酶法检测ATP含量；Fluo-3染色检测胞内钙离子含量；PI染色分析细胞周期。MDC染色观察自噬小泡的形成；Western blot检测自噬通路相关蛋白LC3的蛋白表达；用Heps肝癌荷瘤小鼠模型，评价7-AI-b的在体抗肿瘤作用。
　　 结果显示，通过MTT检测和相差显微镜观察7-AI-b以时间和剂量依赖性方式抑制A549细胞的增殖。化合物分别以4个浓度梯度作用于四种肿瘤细胞株，计笋其IC50值在28-40μmol/L左右。7-AI-b体外作用于A549细胞，细胞核明显发生改变，凋亡的细胞数显著的增加。Western blot结果表明，转位至胞浆中的Cyto C逐渐升高，caspase-3发生了活化，说明7-AI-b诱导A549细胞发生了线粒体介导的凋亡。另外，7-AI-b可以诱导细胞内ROS含量增加，细胞内钙离子超载，线粒体膜电位和ATP含量降低。与传统靛玉红一样，7-AI-b可以诱导肿瘤细胞G0/G1期阻滞。另外，7-AI-b可以诱导肿瘤细胞发生自噬。实验结果还表明ROS可能是7-AI-b引起肿瘤细胞凋亡和自噬的原因。在体内7-AI-b对Heps肝癌的抑制作用与5-Fu相近，而7-AI-b对于小鼠的毒副作用明显小于后者，等剂量的7-AI-b效果也明显优于靛玉红标准品。
　　 以上结果说明，7-AI-b体内可以抑制Heps实体瘤的增殖，并且毒副作用较小；体外可以抑制A549细胞增殖并且诱导其凋亡，其机制与ROS诱导线粒体介导的细胞凋亡和细胞周期阻滞有关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

声明

第一章 引言

1肿瘤及诱导肿瘤细胞的死亡机制

1.1肿瘤细胞的程序性死亡

1.2肿瘤细胞的非程序性死亡

2抗肿瘤药物的研究进展

2.1抗肿瘤药物的研究历史

2.2抗肿瘤药物的分类及作用机制

2.3抗肿瘤天然药物及其结构类似物

3靛玉红及其衍生物抗肿瘤作用研究进展

3.1靛玉红简介

3.2靛玉红及其衍生物抗肿瘤机理

3.3靛玉红及其衍生物的抑瘤的分子学作用机制

4 课题研究思路

第二章 抑制肿瘤细胞增殖的靛玉红类衍生物的筛选

1实验材料

1.1细胞株

1.2药品与试剂

1.3实验仪器

2实验方法

2.1细胞培养

2.2 MTT法检测细胞活性及IC50的测定

2.3 7-AI-b对A549细胞的作用呈时间剂量依敕性

3实验结果

3.1抑制肿瘤细胞增殖化合物的筛选

3.2 7-AI-b对肿瘤细胞IC50的测定结果

3.3 7-AI-b抑制A549细胞增殖的作用呈时间剂量依赖性

4本章小结

第三章 7-AI-b诱导A549细胞死亡机制

1实验材料

1.1细胞株

1.2药品与试剂

1.3实验仪器

2实验方法

2.1细胞培养

2.2用细胞工作站长时间动态观察细胞形态的改变

2.3 Hoechst 33342染色检测细胞核形态

2.4细胞内线粒体提取分离液的配制(分离细胞的线粒体和胞浆)

2.5 Western blot检测蛋白的表达

2.6 AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡

2.7 PI染色分析细胞周期

2.8 DCFH-DA探针法检测细胞内ROS水平

2.9 JC-1染色检测线粒体膜电位

2.10荧光素酶法测定细胞内ATP含量

2.11 Fluo-3检测细胞内钙离子浓度

2.12 MDC染色检测细胞内自噬小泡的形成

2.13统计学方法

3实验结果

3.1 7-AI-b诱导A549细胞凋亡

3.2 7-AI-b诱导A549细胞内产生活性氧(ROS)增多

3.3 7-AI-b诱导A549细胞线粒体膜电位下降

3.4 7-AI-b诱导A549细胞ATP水平降低

3.5 7-AI-b诱导A549细胞内钙离子超载

3.6 7-AI-b诱导A549细胞周期阻滞

3.7 7-AI-b诱导细胞发生自噬

4本章小结

第四章 7-AI-B体内抗肿瘤作用的初步研究

1实验材料

1.1实验动物

1.2主要仪器

1.3药品与试剂

1.4化合物及对照品的配制

2 实验方法

2.1接瘤

2.2实验分组

2.3实验小鼠的喂养

2.4制备样本，计算抑瘤率

2.5检测毒性指标

2.6氧化还原指标的测定

2.7小鼠肿瘤切片观察

2.8统计学方法

3实验结果

3.1 7-AI-b对荷瘤小鼠体重的影响

3.2 7-AI-b对小鼠Heps实体瘤的抑制作用

3.3 7-AI-b对荷瘤小鼠免疫器官的影响

3.4 7-AI-b对荷瘤小鼠肝脏的影响

3.5 7-AI-b对小鼠血清氧还指标的影响

3.6 7-AI-b对小鼠肿瘤组织的影响

4本章小结

第五章 讨论

结论与展望

致 谢

参考文献

在校期间发表的文章