骨髓间质干细胞体内突变致瘤及其肿瘤干细胞分离与生物学特性研究

摘要

目的：研究大鼠间质干细胞体内致瘤模型及致瘤后获得单克隆肿瘤细胞株(K3)的生物学特性；建立K3肿瘤干细胞(K3-SP)分离、鉴定的方法；初步采用细胞生物学与分子生物学技术等探讨K3肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞的生物学特性及基因表达；探讨无血清培养对K3肿瘤干细胞的富集作用。
　　 方法：采用生长曲线、流式表面标记、PCR、免疫组化等技术来研究K3细胞的生物学特性。制备K3细胞悬液，经过Hoechst33342荧光染料染色，流式细胞仪分析并分选出SP亚群。采用五种培养方法培养K3：5％FBS、10％FBS、无血清、无血清加三种生长因子培养K3及K3细胞BALB/c裸鼠皮下致瘤。获得足够量的K3细胞后，取瘤组织过400目铜网得到单细胞悬液。单细胞悬液经过Hoechst33342荧光染料染色，使用流式细胞仪分选出K3-SP细胞和K3-NSP-细胞。分选得到的K3-SP细胞和K3-NSP细胞进行BALB/c裸鼠皮下致瘤实验并观察比较瘤体积的大小。使用晶芯(R)大鼠全基因组寡核苷酸微阵列芯片比较K3-SP/K3-NSP细胞基因表达差异，使用荧光实时定量RT-PCR验证差异表达基因。比较K3-SP致瘤组织和K3-SP致瘤组织ABCG2、OCT4、PCNA、P53的免疫组化结果。利用无血清培养以富集K3-SP细胞。
　　 结果：K3肿瘤细胞表达大鼠间质干细胞相似的表面抗原如CD29,CD44,CD90,弱表达CD45；K3肿瘤细胞具有一般肿瘤细胞表达基因与生长特性，能够在BALB/c裸鼠致瘤；K3肿瘤细胞具有异质性，同时含有少量的肿瘤干细胞。不同胎牛血清浓度培养下，K3细胞中K3-SP细胞含量有差异，5％FBS培养与10％FBS培养分析得K3-SP含量分别为1.01％和0.73％。K3-SP较K3-NSP BLAB/c裸鼠致瘤率明显增强，5×103K3-SP细胞即可裸鼠致瘤，其组织类型为纤维肉瘤。基因芯片分析显示，K3-SP与K3-NSP差异表达基因56个，其中上调40个，下调16个，Real-timePCR验证了T-Bx3、Mafb、Plk2等上调基因和Vegf一个下调基因。免疫组化显示K3-SP致瘤组织为P53、Pcna、Abcg2、Oct4阳性，而K3-NSP致瘤组织为阴性。K3细胞在含有bFGF、EGF、LIF三种因子的无血清培养基与不含三种因子的培养基中均呈悬浮球状生长，Real-time PCR显示Oct4在两种无血清培养基中表达均有差异。无血清加三种因子培养基中培养15天后，SP含量达到7.73％，具有明显的富集K3-SP的作用。
　　 结论：K3肿瘤细胞源于骨髓MSC突变致瘤，其中含有K3-SP细胞，K3-SP细胞与K3-NSP细胞在致瘤性、基因表达等方面存在明显的差异，K3-SP细胞具有较强的致瘤能力。无血清加因子培养能够明显的富集K3-SP，这些研究为寻找K3-SP细胞的特异性分子标志和K3-SP的深入研究提供实验依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1间质干细胞

1.1.1间质干细胞生物学特性及应用

1.1.2间质干细胞突变致瘤

1.2肿瘤干细胞

1.2.1肿瘤发生与肿瘤干细胞理论

1.2.2肿瘤干细胞研究历史

1.2.3肿瘤干细胞的生物学特性

1.2.4肿瘤干细胞与耐药

1.2.5肿瘤干细胞的分离

1.2.6肿瘤干细胞与SP细胞

1.2.7肿瘤干细胞的鉴定

1.2.8肿瘤干细胞的研究意义

第二章研究目的、方法、实验设计方案和意义

2.1研究目的

2.2研究方法

2.3实验设计方案

2.3.1 K3细胞的生物学特性研究

2.3.2 K3肿瘤干细胞分离、鉴定及生物学特性对比研究

2.3.3无血清培养基培养后K3细胞的生物学特性

2.4研究意义

第三章 K3细胞来源及生物学特性

3.1试剂与仪器

3.1.1主要试剂

3.1.2主要仪器、耗材

3.2方法

3.2.1细胞培养

3.2.2流式细胞仪检测瘤及K3细胞表面标记

3.2.3裸鼠致瘤实验

3.2.4细胞爬片制作及免疫组织化学染色

3.2.5总RNA提取以及逆转录

3.2.6 PCR扩增

3.2.7流式细胞分析

3.3结果

3.3.1大鼠尾部细胞致瘤及K3细胞表面标记与基因表达

3.3.2 SD大鼠瘤细胞和K3细胞形态

3.3.3 K3细胞免疫组化基因表达分析

3.3.4 K3细胞致瘤实验

3.3.5 K3SP细胞含量分析

3.4讨论

第四章K3肿瘤干细胞分离鉴定及生物学特性

4.1试剂与仪器

4.1.1主要试剂

4.1.2主要仪器、耗材

4.2方法

4.2.1细胞培养

4.2.2 Hoechst 33342染色

4.2.3 K3-SP流式细胞分选

4.2.4 RNA提取以及逆转录

4.2.5 PCR扩增

4.2.6 T-A克隆

4.2.7荧光定量PCR

4.2.8石蜡切片制作及免疫组织化学染色

4.2.9裸鼠致瘤实验

4.2.10基因芯片

4.2.11统计分析

4.3结果

4.3.1 K3细胞Hoechst 33342染色

4.3.2裸鼠致瘤模型

4.3.3基因芯片

4.3.5荧光定量PCR验证基因芯片结果及干细胞相关基因

4.3.6免疫组化结果

4.4讨论

第五章无血清培养对K3-SP细胞的富集作用

5.1试剂与仪器

5.1.1主要试剂

5.1.2主要仪器、耗材

5.2方法

5.2.1细胞培养

5.2.2生长曲线

5.2.3 K3流式细胞检测

5.2.4 RNA提取以及逆转录

5.2.5 PCR扩增

5.2.6 T-A克隆

5.2.7荧光定量PCR

5.2.8统计分析

5.3结果

5.3.1 K3细胞在不同培养条件下培养形态

5.3.2流式细胞术不同培养条件下SP细胞含量分析

5.3.3 5%FBS、无血清、无血清加因子培养条件K3生长曲线

5.3.4无血清、无血清加因子培养条件下Oct4基因表达差异

5.4讨论

结论及展望

一、结论

二、展望

致 谢

参考文献

攻读硕士学位期间获奖及发表的学术论文