甲基汞急性暴露诱导大鼠脑内质网应激:时间及剂量效应关系研究

摘要

目的：甲基汞是全球性的环境污染物,但毒性机制一直未能明了,内质网应激是机体应答内源性和外源性应激的重要机制。本研究通过整体动物染毒实验,探讨甲基汞急性暴露诱导大鼠不同脑区内质网应激的时间效应关系,并初步探讨内质网应激与氧化应激损伤的关系；在获得的研究基础上又进一步研究了甲基汞对大鼠大脑皮层和小脑诱导内质网应激的剂量效应关系。
　　 方法(一)甲基汞急性暴露诱导不同脑区内质网应激的时间-效应研究:42只SD大鼠随机分为7组,腹腔注射4 mg／Kg氯化甲基汞,并在0.5、1、3、6、12、24 h后麻醉断头处死,同时设生理盐水对照组。蛋白印迹法测定小脑、大脑皮层、脑干、海马和纹状体5个脑区内质网应激的标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78,Grp78)的表达,并测定大脑皮层内过氧化氢酶(CAT)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)含量。(二)甲基汞急性暴露诱导大脑皮层和小脑的剂量-效应关系研究:30只SD大鼠随机分为6组,对照组(等体积生理盐水)、2mg／kg、4 mg／Kg、6 mg／Kg、8 mg／Kg、10 mg／kg氯化甲基汞,6 h后麻醉断头处死,蛋白印迹法测定大脑皮层和小脑内质网应激标志性蛋白Grp78的表达；实时荧光定量PCR方法测定大脑皮层蛋白Grp78 mRNA的表达。
　　 结果(1)蛋白印迹法结果显示急性甲基汞染毒后,小脑、大脑皮层、脑干、海马和纹状体等5个脑区Grp78蛋白表达水平均显示了先升高后降低的变化趋势。在0.5 h开始升高,并且在6 h或12 h达到高峰,然后逐渐下降,在24 h接近空白对照组水平,其中大脑皮层与脑干Grp78蛋白的时间效应变化与空白对照组相比分别具有统计学意义。大脑皮层在染毒6 h时处在最高峰,Grp78蛋白表达量与空白对照组相比增加约50％。脑干在染毒12 h处在最高峰,Grp78蛋白表达量比空白对照组增加约40％。抗氧化能力测定结果显示,与空白对照组相比,大脑皮层中CAT活性呈现一直增高的趋势,0.5 h开始升高,在24 h达到最高。还原型GSH含量呈现先降低后缓慢升高的趋势,显示与蛋白Grp78的变化正好相反的趋势。(2)不同剂量的甲基汞染毒后,大脑皮层和小脑在Grp78蛋白表达水平都显示了先升高后降低的趋势,在2 mg／kg即开始升高。其中大脑皮层在6 mg／Kg达到高锋,然后下降,8 mg／kg接近空白对照组水平,并在染毒剂量为6 mg／kg时,蛋白Grp78的表达量与空白对照组相比增加约80％。在4、6、8mg／kg小脑Grp78蛋白的剂量效应变化与空白对照组相比具有统计学意义。实时荧光定量PCR测定结果显示,大脑皮层在mRNA水平显示了先升高再下降的趋势,在2 mg／Kg开始升高,并在8 mg／kg接近高峰,然后下降,在10 mg／kg低于空白对照组水平。其中在染毒剂量为8 mg／kg时,蛋白Grp78的mRNA水平与空白对照组相比增加约65％。
　　 结论(1)甲基汞急性暴露诱发脑内质网应激具有时间效应和脑区特异性,其中大脑皮层最为敏感,这种内质网应激效应可能与氧化应激损伤有关。(2)甲基汞急性暴露诱导大鼠大脑皮层和小脑内质网应激具有显著的剂量-效应关系,且grp78 mRNA水平改变明显滞后于Grp78蛋白水平的改变。

目录

文摘

英文文摘

第一章 引言

1.1 甲基汞的概况与毒性作用

1.2 甲基汞的神经毒性机制与内质网应激

1.3 内质网与内质网应激

1.3.1 内质网

1.3.2 内质网应激

1.3.3 内质网应激的标志性蛋白Grp78

1.4 内质网应激与氧化应激

1.4.1 氧化应激

1.4.2 甲基汞与内质网应激和氧化应激关系的研究进展

1.5 研究目的与意义

第二章 甲基汞急性暴露诱导内质网应激的时间效应研究

2.1 主要材料和仪器

2.1.1 实验动物

2.1.2 主要实验药品及试剂

2.1.3 主要仪器及耗材

2.1.4 主要试剂配制

2.2 方法

2.2.1 动物处理

2.2.2 组织蛋白提取

2.2.3 BCA法蛋白定量

2.2.4 Western Blot

2.2.5 统计学分析

2.3 结果与讨论

2.3.1 甲基汞急性暴露对不同脑区Grp78蛋白表达的影响

2.3.2 甲基汞急性暴露对大脑皮层CAT活力的影响

2.3.3 甲基汞急性暴露对大脑皮层还原型GSH的影响

2.3.4 大脑皮层Grp78蛋白水平与GSH含量的相关关系

2.3.5 讨论

第三章 甲基汞急性暴露诱导内质网应激的剂量效应研究

3.1 主要材料和仪器

3.1.1 实验动物

3.1.2 主要实验药品及试剂

3.1.3 主要仪器及耗材

3.1.4 主要试剂配制

3.2 方法

3.2.1 动物处理

3.2.2 提取大脑皮层组织中的总RNA

3.2.3 mRNA反转录成cDNA

3.2.4 聚合酶链反应(PCR)

3.2.5 胶回收试剂盒进行胶回收

3.2.6 TA克隆

3.2.7 制定标准曲线

3.2.8 Realtime PCR

3.2.9 Western Blot及其他方法

3.3 结果与讨论

3.3.1 甲基汞急性暴露对小脑Grp78蛋白表达的影响

3.3.2 甲基汞急性暴露对大脑皮层Grp78蛋白表达的影响

3.3.3 甲基汞急性暴露对大脑皮层Grp78 mRNA水平的影响

3.3.4 讨论

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

参考文献

致谢

在学期间发表的学术论文及参加的学术会议与奖励